2. 江西中医药大学 科技学院，江西 南昌 330004;
3. 江西中医药大学 研究生院，江西 南昌 330004;
4. 江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004
2. Science and Technology College, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China;
3. Postgraduate School, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China;
4. Key Lab of Modern Preparation of TCM, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China
Janus活化激酶(Janus activated kinase, JAK)/信号转导与转录激活子(signal transducer and activator of transcriptions, STAT)途径介导了炎症性肠病的发生和发展[1]。黄芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)是黄芪的主要活性成分之一，可有效治疗实验性结肠炎[2]，但其作用机制是否与调节结肠黏膜JAK/STAT信号表达有关尚不清楚。
1 材料 1.1 动物及分组清洁级健康C57BL/6小鼠40只，♂，体质量(20 ± 2) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。随机分为4组，即正常组(Normal)、模型组(TNBS)、黄芪多糖组(TNBS+APS)、美沙拉嗪组(TNBS+Mes)，每组10只，适应性饲养3 d。
1.2 药物与试剂APS购自陕西森弗生物技术有限公司；美沙拉嗪购自佳木斯鹿灵制药有限公司；三硝基苯磺酸(2, 4, 6 -trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)购自Sigma公司；JAK2、p-JAK2、STAT6、p-STAT6、SOCS1、SOCS3抗体均购于Abcam公司。
1.3 仪器低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；电泳仪(Bio-Rad公司)；CO2恒温培养箱(力新仪器)；漩涡混匀器(德国IKA公司)。
2 方法 2.1 动物模型的制备与给药[3]造模前禁食12 h，除正常组外，小鼠麻醉后，按100 mg·kg-1 TNBS计算，将其溶入0.15 mL 50%乙醇配制TNBS乙醇复合溶液，并注入距肛门约4 cm处，倒置小鼠5 min，放回原笼中自然苏醒。造模24 h后，按体质量换算，黄芪多糖200 mg·kg-1灌胃，美沙拉嗪组给予美沙拉嗪150 mg·kg-1灌胃，每日1次，连续7 d。
2.2 动物处理与病理学观察d 8，分离结肠，测量长度，观察肠黏膜损伤程度，称量。准备病理切片，光学显微镜观察并评分。
2.3 Western blot检测相关蛋白分子表达制备结肠组织匀浆，测蛋白含量。电泳后电转PVDF膜上，加JAK2、p-JAK2、STAT6、p-STAT6、SOCS1、SOCS3、GAPDH一抗，4℃孵育过夜，二抗孵育1 h后，曝光显影，进行条带灰度值的分析。
2.4 统计学方法采用SSPS17.0统计软件统计分析，实验结果以x±s表示。组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。
3 结果 3.1 结肠长度、重量及病理损伤程度评测如Tab 1所示，与模型组相比较，APS组结肠长度无明显缩短(P＜0.01)，肠重、结肠重量指数及病理损伤评分明显下降(P＜0.05或P＜0.01)。同时病理形态学观察可见，经APS和美沙拉嗪治疗后，结肠黏膜相对完整，少量炎细胞浸润，无明显溃疡形成。
| Group | Colonic weight/g | Index of colonic weight | Colonic length/cm | Histological score |
| Normal | 0.19±0.02 | 0.79±0.08 | 7.50±0.11 | 0.44±0.23 |
| TNBS | 0.23±0.02** | 0.98±0.06** | 6.63±0.39** | 4.24±0.44* |
| TNBS+APS | 0.19±0.03# | 0.87±0.06## | 7.44±0.75# | 2.56±0.58## |
| TNBS+Mes | 0.20±0.02## | 0.83±0.08# | 7.55±0.13# | 1.88±0.45## |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs normal; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs TNBS model | ||||
与模型组相比较，APS给药后，结肠黏膜p-JAK2和p-STAT6表达明显下降，且p-JAK2/JAK2和p-STAT6/STAT6比值也明显下降(P＜0.05或P＜0.01)，而SOCS1和SOCS3的表达明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。
4 讨论本实验发现，APS可明显降低结肠炎小鼠结肠质量指数，恢复结肠长度，缓解结肠黏膜病理性损伤，提示APS可有效治疗TNBS诱导的小鼠结肠炎。同时发现经APS治疗后，结肠炎小鼠结肠黏膜JAK2和STAT6蛋白磷酸化表达明显下降，而SOCS1和SOCS3的表达明显升高，提示APS有效治疗小鼠结肠炎可能是通过抑制JAK/STAT信号活化实现的。
JAK/STAT途径广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节等过程[1]，其负性调控与SOCS正相关，该信号可通过树突状细胞调控Th1/Th2和Th17/Treg型细胞因子间平衡。如树突状细胞可通过JAK/STAT高度表达IL-12而诱导Th1型细胞产生；JAK/STAT被抑制，则IL-12、IFN-γ和IL-23产生减少，诱导Th2细胞增加[4]。或DCs激活STAT3，增加IL-10和TGF-β表达，最终诱导Treg增殖[5]。Th1/Th2和Th17/Treg型细胞因子间平衡及其细胞因子在溃疡性结肠炎的发病过程中扮演重要角色。我们前期研究基础发现，APS有效治疗实验性结肠炎的同时，肠黏膜组织Treg细胞水平升高，且IL-2、IL-6、IL-17、IL-23下调，TGF-β1和STAT5a水平升高，提示APS有效治疗UC可能是通过调节Treg/Th17间平衡来实现[6]。结合本实验，APS给药治疗后，小鼠结肠黏膜中JAK/STAT信号活化明显抑制，而SOCS1和SOCS3的表达明显升高，说明APS可能通过抑制JAK/STAT信号活化达到治疗目的。我们预测其可能和APS通过该途径调控树突状细胞成熟和活化有关，需要进一步研究，此将有助于全面揭示APS调节免疫治疗结肠炎的作用机制。
| [1] | 贺宏英, 吴绥生. JAK/STAT信号转导途径研究新进展[J]. 新医学, 2009, 40(12): 827-30. He H Y, Wu S S. New progress of JAK/STAT signaling pathway[J]. New Med, 2009, 40(12): 827-30. doi:10.3969/j.issn.0253-9802.2009.12.022 |
| [2] | Yang M, Lin H B, Gong S, et al. Effect of Astragelus polysaccharides on expression of TNF-α, IL-1β and NFATc4 in a rat model of experimental colitis[J]. Cytokine, 2014, 70(2): 81-6. doi:10.1016/j.cyto.2014.07.250 |
| [3] | 刘端勇, 黄敏芳, 徐荣, 等. 黄芪多糖对结肠炎大鼠小肠PP结中T淋巴细胞亚群的调节作用[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(9): 1328-9. Liu D Y, Huang M F, Xu R, et al. Effect of Astragalus polysaccharides in regulating the T lymphocyte subgroup in intestinal PPs of rat with colitis[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(9): 1328-9. |
| [4] | Yoshimura A, Naka T, Kubo M. SOCS proteins, cytokine signaling and immune regulation[J]. Nat Rev Immunol, 2007, 7(6): 454-65. doi:10.1038/nri2093 |
| [5] | Li Y, Chu N, Rostami A, et al. Dendritic cells transduced with SOCS3 exhibit a tolerogenic DC2 phenotype that direct type 2 Th cell differentiation in vitro and in vivo[J]. J Immunol, 2006, 177: 1679-88. doi:10.4049/jimmunol.177.3.1679 |
| [6] | Zhao H M, Wang Y, Huang X Y, et al. Astragalus polysaccharide attenuates rat experimental colitis by inducing regulatory T cells in intestinal Peyer's patches[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(11): 3175-85. doi:10.3748/wjg.v22.i11.3175 |