2. 广西医科大学 基础医学院生物化学与分子生物学教研室，广西 南宁 530021
2. Dept of Biochemistry and Molecular Biology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China
肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，是肝脏对于各种慢性刺激损伤进行自我修复的一种病理过程，最终可能发展为肝硬化、肝功能衰竭等肝脏疾病。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是细胞合成并分泌到胞外，分布在细胞表面或细胞间的大分子，其增生与降解失衡可导致肝内结缔组织沉积，从而导致肝纤维化。肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)作为肝脏组织中ECM的主要合成细胞，其增殖与凋亡直接影响肝纤维化的发生与发展[1]。近期有研究表明，HSC在肝细胞癌(hepatocellular carcinnoma，HCC)的发生、发展和转移中可能至关重要，被激活的HSC可以异常分泌一些细胞因子，如IL-8、FGF1/2、PDGF、IGF等，此类因子会促进HCC的进展[2-3]。因此，诱导HSC凋亡、抑制其增殖成为预防和治疗肝纤维化、肝癌和一些其他肝脏疾病的一个重要途径，对HSC凋亡机制的研究也显得尤为重要[4]。PI3K/Akt作为大鼠HSC中的重要信号通路已被证明可通过控制其上游或下游蛋白，影响细胞增殖与凋亡[5]。研究表明[6-7]，硫化氢、氧化氮类化合物以及神经生长因子(nerve growth factor，NGF)可以通过调节PI3K/Akt信号通路，抑制大鼠HSC的增殖并诱导其凋亡，从而对肝纤维化发挥良好的干预作用。NGF作为近年来发现的HSC凋亡诱导剂，已在肝纤维化的研究中引起广泛重视[8-9]。本实验室从眼镜蛇毒中提取NGF，得率高、纯度高、方法简单。并且前期实验证实，NGF可通过PI3K/Akt信号通路抑制大鼠肝星状细胞HSC-T6的增殖，最小有效浓度为4 mg·L-1，最大抑制率约为60%。但近年来，对人HSC的研究甚少。本研究以人HSC-LX2为研究对象，采用CCK-8法、流式细胞术和Western blot检测NGF对LX2细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制，以期为治疗肝脏疾病提供新思路。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器人肝星状细胞株LX2，由广西医科大学病理学教研室馈赠；眼镜蛇毒神经生长因子(NGF)由本实验室提取；GAPDH抗体、Akt抗体、辣根过氧化物酶荧光标记羊抗兔抗体、PI3K/Akt信号通路的特异性抑制剂LY294002，均购自Abcam公司；Annexin V-FITC/7-AAD凋亡试剂盒(6084648)购自BD公司；CCK-8试剂盒(KL640)购自日本同仁公司。酶标仪(Biotek公司，型号：ELX800)；流式细胞仪(BD公司，型号：FACScalibur)。
1.2 方法 1.2.1 眼镜蛇毒NGF的提取广西眼镜蛇毒粗毒冻干粉溶解、离心、0.45 μm滤膜过滤，经DEAECL-6B阴离子交换层析柱、G-50凝胶分子筛、MACRO-PREP HIGH S强阳离子交换层析柱三步分离纯化后，收集活性峰，透析、冻干，质谱检测，电泳鉴定，PC-12细胞活性鉴定，所得产物即为NGF。0.22 μm滤膜过滤除菌，-20℃保存备用[10]。
1.2.2 LX2细胞培养将LX2细胞株置于含10%胎牛血清、1%青-链霉素的RPMI 1640完全培养液中，37℃、5% CO2培养箱中培养过夜，细胞贴壁后，换液处理。细胞达到90%融合度，弃去培养基，PBS洗细胞3次，彻底清除血清后，0.25%胰酶消化1 min，加入完全培养基终止消化，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清；2 mL新鲜培养液重悬，细胞计数，以每孔1 000个细胞数接种于96孔培养板中。每次实验均在细胞指数生长期时进行。
1.2.3 实验分组本实验分为空白组、实验组(NGF组)、对照组(LY294002)。实验组分别按照0.1、0.5、1、2、4、8、16 mg·L-1浓度梯度加入NGF；对照组加入50 μmol·L-1 LY294002，空白组加入等体积的PBS。
1.2.4 CCK-8法测定细胞增殖抑制率取对数期生长期的LX2细胞，计数，以每孔1 000个细胞数接种于96孔板，共7组，每组设6个复孔。待细胞贴壁后，吸出培养基，用PBS洗3次，加入无血清的培养基饥饿处理12 h，使细胞同步化。按照实验设计及分组，加入相应剂量的NGF/LY294002，37℃细胞培养箱孵育24 h，弃去孔内培养基，PBS洗3次，每孔加90 μL RPMI 1640完全培养基、10 μL CCK-8，37℃孵育2 h，待颜色变深后，酶标仪450 nm波长处测定OD值，根据公式计算细胞增殖抑制率。抑制率/%=(培养基孔OD值-实验孔OD值)/(对照孔OD值-培养基孔OD值)×100%。
1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期的LX2细胞，以2×105/孔的密度接种于6孔板，十字震荡混匀，待细胞贴壁后，用无血清RPMI 1640培养液同步化12 h，按照实验分组加入相应剂量的NGF/LY294002，继续培养24 h后，弃培养基，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化，加入新鲜培养基终止消化，离心弃上清，取1×106细胞/管于流式管中。按照Annexin V-FITC/7-AAD凋亡试剂盒说明书进行染色，避光孵育30 min后，上机进行流式检测。
1.2.6 Western blot分析Akt磷酸化水平取对数生长期的LX2细胞2×105个/孔接种于6孔培养板，用无血清RPMI 1640培养液饥饿处理12 h，按不同分组分别加入PBS、NGF (最小有效浓度)、LY294002 (50 μmol·L-1)、NGF (最小有效浓度) +LY294002(50 μmol·L-1)作用最小作用时间。处理后的LX2细胞用预冷的PBS洗3次，每孔加入50 μL细胞裂解液(含PMSF、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂)，冰上裂解10 min，13000 r·min-1离心30 min，收集上清，BCA法测蛋白浓度。以GAPDH为内参，Western blot检测蛋白表达量，用ODYSSEY系统进行定量。
1.3 统计学处理使用SPSS 17. 0软件，数据以x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检测。
2 结果 2.1 不同处理因素对LX2细胞增殖的影响如Fig 1所示，随着作用于细胞的NGF浓度的增大，LX2细胞增殖抑制率逐渐增大，当NGF浓度达到8 mg·L-1时，增殖抑制率达到平台期，上升缓慢。其中，最小有效浓度为1 mg·L-1，当NGF浓度为1 mg·L-1以下时，与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；当NGF浓度为1 mg·L-1及以上时，与空白组比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)；对照组与空白组以及实验组各浓度相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
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| Fig 1 The inhibitory rate of LX2 proliferation after treatment with different factors determined by CCK-8 *P < 0.05, **P < 0.01 vs blank group |
如Fig 2所示，经流式细胞术检测，在不同浓度NGF作用下，LX2细胞凋亡程度不同，且随着NGF浓度增加，细胞凋亡率逐渐增大。经计算，当NGF浓度为1、8 mg·L-1时，与空白组凋亡率比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。
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| 图 2 Apoptosis of LX2 cells under different treatment factors A: Blank group; B: NGF 1mg·L-1; C: NGF 8mg·L-1; D: LY294002 50 μmol·L-1; E: Apoptosis rate of LX2 cells under different treatment factors. **P < 0.01 vs blank group |
Fig 3的Western blot结果显示，当加入NGF(1 mg·L-1)、LY294002 (50 μmol·L-1)后，p-Akt的表达量顺序为：空白组(PBS)>NGF组>LY294002组>NGF+LY294002组，Akt的表达量基本没有变化。提示NGF对Akt的磷酸化具有抑制作用。
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| Fig 3 Phosphorylation of Akt protein in LX2 cells detected by Western blot **P < 0.01 vs blank group |
肝纤维化是多种慢性肝病进展至肝硬化的中间过程, 是肝癌发展的早期表现，其特征为以胶原蛋白为主的ECM合成与降解失衡。因此，揭示肝纤维化发生、发展机制以及抑制其发展，成为预防和控制肝硬化、肝癌和其他一些肝脏疾病发展的重要途径。HSC作为产生ECM的关键细胞，减少活化HSC的数量是预防和治疗肝脏疾病的有效方法[11]。研究表明，过氧化氢、硫化氢、EZH2等可通过作用于PI3K通路、TGFβ-Smad通路、ROCK通路、MAPK通路等信号通路，影响通路下游多种效应分子的活化状态，从而对HSC的增殖、凋亡、转录、翻译、代谢、新血管生成以及细胞周期进行调控[12-13]。眼镜蛇毒NGF是一种神经营养因子，可通过使HSC细胞周期停滞于G2期而抑制HSC增殖；经NGF作用的大鼠HSC可出现明显的增殖受抑、细胞凋亡的形态学改变[14]。有研究发现，眼镜蛇毒NGF能改变HSC-T6信号通路中某些蛋白的表达量，使HSC-T6细胞增殖受到抑制，从而逆转肝纤维化过程。
本研究通过CCK-8、流式细胞术、Western blot等技术分别检测了在PBS、NGF、LY294002作用下，LX2细胞增殖、凋亡和蛋白表达的情况。结果显示，眼镜蛇蛇毒中提取的神经生长因子NGF以不同浓度作用于LX2细胞时，均可对细胞的增殖率起到直接抑制作用，并且具有浓度依赖性，其最小有效浓度为1 mg·L-1, 当浓度为8 mg·L-1时达到平台期，最大增殖抑制率约为63%。与张可星等[15]实验结果(NGF抑制HSC-T6增殖的最小浓度为4 mg·L-1)相比，最小有效浓度降低。流式细胞术结果表明，NGF促进LX2细胞凋亡也具有一定的浓度相关性，与对照组LY294002的作用结果相比不具统计学意义，说明NGF可促进LX2细胞凋亡，且与LY294002有类似作用。Western blot实验结果表明，NGF和LY294002均使p-Akt的表达量降低，Akt的表达量基本没有变化，NGF能够有效抑制PI3K/Akt信号通路中Akt蛋白的磷酸化，从而抑制LX2细胞的增殖，与通路抑制剂联合使用时效果加强。综合以上实验结果，我们推论，眼镜蛇毒NGF可抑制LX2细胞增殖，促进其凋亡，其作用机制可能与降低PI3K/Akt信号通路中Akt蛋白的磷酸化有关。PI3K/Akt信号通路与其他信号通路之间的关系，及其与各种影响因素之间的关系，也值得进一步研究和探讨。
综上所述，本研究为发现预防及治疗肝纤维化的新作用靶点提供基础。NGF作为重要的促HSC凋亡的物质在眼镜蛇毒中含量十分丰富, 研究眼镜蛇蛇毒NGF抑制HSC增殖的机制，对阐明肝纤维化的发病机制、寻找肝纤维化的防治药物及临床治疗肝纤维化有着积极的意义。
( 致谢: 本实验在广西医科大学实验中心蛇毒研究所完成，感谢各位老师和同学对实验的指导与帮助！)
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