2. 加州大学纳米研究所，洛杉矶，CA 90095，美国
2. California NanoSystems Institute, University of California, Los Angeles, CA 90095, USA
食管癌是发生于食管上皮组织的恶性肿瘤，是全球最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内，食管癌发生率高居第8位，死亡率居于第6位，中国是世界上食管癌高发国家，具有发病率高、治愈率差、病死率高等特点。在我国大部分地区，尤其是高发区河南省林州市，仍然是导致人死亡的主要原因之一[1]。食管癌早、中期有治愈可能，晚期难度较大，传统的治疗手段如手术、化学和放射治疗仍然存在损伤性大、并发症多、毒副作用强等问题，因此，肿瘤靶向的基因治疗具有重要意义[2]。
RNA干扰(RNA interfering，RNAi)是双链RNA介导的一种有效的、高度特异的基因沉默现象，它能有效地抑制体内外基因的表达。食管鳞状细胞癌特异相关LncRNA转录物1(esophageal squamous cell carcinoma specifically associated long non-coding RNA transcript 1, ESCCAL_1)是我们课题组发现的在食管鳞状细胞癌中高表达的LncRNA，且体内、外实验均证实其在食管鳞状细胞癌的增殖、凋亡、侵袭、转移、成瘤等过程中具有癌基因功能[3-4]。因此，通过小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)诱导的RNAi抑制ESCCAL_1 LncRNA的表达是一种新的肿瘤治疗途径。siRNA表面带负电荷、相对分子质量大，因此，其与细胞膜相互作用受到抑制，通过细胞膜的被动扩散也受到限制[5]。所以，siRNA在体内、外使用时需要一种有效的基因载体。
近年来，介孔材料凭借其独特的结构特征以及优良的理化性能，在化学、光电子学、材料学等诸多领域拥有巨大的应用前景。介孔二氧化硅纳米微粒(mesoporous silica nanoparticle, MSNP)兼具介孔材料和纳米材料的双重特性，具有一定范围内连续可调的均一孔径、规则的圆柱形孔道、稳定的骨架结构、易于修饰的内外表面、良好的生物相容性等特点[6-7]，适合用作药物或基因载体。本实验以对ESCCAL_1 LncRNA起干扰作用的siRNA为对象，制备PEI修饰的纳米复合物，并在体外研究对食管癌EC-9706细胞增殖的抑制作用、转染效率以及对ESCCAL_1 LncRNA表达的影响进行了研究。
1 材料 1.1 细胞人食管癌细胞株EC-9706购自中国科学院细胞库，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在饱和湿度、5% CO2、37℃的细胞培养箱中恒温培养。
1.2 试剂PEI(相对分子质量2.5×104，Sigma公司，美国)；培养基和胎牛血清(Gibco，美国)；RT-PCR试剂盒、TRIzol提取试剂、PCR引物(大连宝生物)；其他试剂均为分析纯。
1.3 仪器透射电镜(FEI公司，美国)；酶标仪(Bio-TEK，美国)；CO2恒温细胞培养箱(SANYO，日本)；荧光倒置显微镜(Olympus，日本)；流式细胞分析仪(BD Biosciences，美国)。
2 方法 2.1 MSNP及MSNP-PEI的制备及理化性质的测定100 mg十六烷基三甲基溴化铵溶解于48 mL去离子水，依次加入350 μL 2 mol·L-1氢氧化钠、500 μL正硅酸乙酯，15 min后加入127 μL 3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯，80℃油浴继续搅拌2 h，离心(18 000 r·min-1，20 min)，去离子水、无水乙醇各洗2次，所得粒子分散在20 mL无水乙醇与1 mL浓盐酸混合溶液中，70℃水浴冷凝回流24 h，离心后，去离子水、无水乙醇各洗2次，所得粒子冻干待用。称取MSNP 12.5 mg分散在5 mL去离子水中，称取PEI 25 mg，加5 mL无水乙醇超声分散，将PEI乙醇溶液逐渐滴加到MSNP水溶液中，搅拌30 min，离心，去离子水、乙醇各洗2次，所得粒子冻干保存。
2.2 凝胶电泳测定纳米复合物包封率采用琼脂糖凝胶电泳法。琼脂糖浓度1.2%(W/V)，1.0×TAE缓冲电泳液，点样6个孔，分别为：① siRNA；②装载siRNA的纳米复合物；③载siRNA的纳米复合物和肝素钠及10% Triton X-100。点样5 μL，100 V运行10 min，全自动凝胶成像系统分析结果。
2.3 EC-9706细胞体外增殖实验采用MTT比色法。将处于对数生长期的EC-9706细胞(5×107个/孔)接种在96孔培养板上，常规培养24 h后，100 nmol·L-1的纳米复合物转染，转染6 h后，更换含10%血清的RPMI 1640培养基，分别作用24、48、72 h，吸弃原培养基，每孔加入10 μL 5 g·L-1的MTT和100 μL培养基的混合液，继续培养4 h后，每孔加入100 μL甲月赞裂解液，孵育使甲月赞结晶溶解。酶标仪测570 nm处各孔的吸光度值(A)，以PBS为空白对照，计算各组细胞抑制率。
2.4 体外细胞摄取实验将经灭菌处理的盖玻片平铺于6孔培养板的孔中，接种EC-9706细胞(5.0×105个/孔)，常规培养24 h后，用无血清无双抗的RPMI 1640培养基冲洗1次；加入绿色荧光FAM标记siRNA的纳米复合物(终浓度为100 nmol·L-1)转染6 h；对照组加入无血清和无双抗的培养基。吸弃原培养基，PBS冲洗2次，75%的冰乙醇固定，30 min后吸弃乙醇，取出盖玻片，放置在载玻片上，荧光显微镜下观察体外细胞摄取情况。
2.5 半定量RT-PCR两步法测定EC-9706细胞中ESCCAL_1 LncRNA的表达将EC-9706细胞(5.0×105个/孔)接种于6孔培养板中，常规培养24 h后，分别用100 nmol·L-1的siRNA、纳米复合物转染，转染6 h后，更换为含10%血清的RPMI 1640培养基继续培养。72 h后，采用TRIzol一步法总RNA提取试剂盒提取总RNA，并进行cDNA的合成及PCR的扩增。通过Primer5.0软件设计2条ESCCAL_1引物序列及2条内参GAPDH引物(Tab 1)。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循环34次，72℃延伸7 min，4℃保存。取5 μL扩增产物于1.2%的琼脂糖凝胶分析，凝胶成像系统采集结果，图像分析软件Quantity One分析结果，计算ESCCAL_1基因LncRNA的相对表达量。
| Target gene | Primer sequences | Fragment length/bp |
| GAPDH | F: 5′-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3′ | 309 |
| R: 5′-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3′ | 174 | |
| ESCCAL_1 | F:5′-CCAGACAGCAGCAAAGCAAT-3′ | |
| R: 5′-GGAAGCAGCAAATGTGTCCAT-3′ |
应用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理，结果以x±s表示；两样本的均数比较用t检验，多样本的均数比较用方差分析(ANVOA)。
3 结果 3.1 MSNP、MSNP-PEI的表征如Fig 1所示，合成的MSNP、MSNP-PEI透射电镜观察到MSNP、MSNP-PEI粒子形态规则，呈球形，粒径分布在60~70 nm之间，粒子表面有直径为3~5 nm的介孔。Tab 2显示，动态光散射(DLS)测得MSNP、MSNP-PEI的粒径分别为89.9、105 nm，为水合半径，比干燥后的透射样品粒径大些。MSNP的电势为-15.28 mV，与PEI结合形成MSNP-PEI后，电势变为+34.64 mV，能够与带负电的质粒相结合。
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| Fig 1 TEM images (×10) A:Bare MSNP; B:PEI1.8k-PEG5K coated MSNP |
| TEM size /nm | DLS size /nm (PDI) | Zeta potential /mV | |
| Bare MSNP | 65.8±6.1 | 89.9±0.4 (PDI 0.028) | -15.28±0.90 |
| PEI-PEG coated MSNP | 64.7±5.8 | 105.0±0.6 (PDI 0.053) | +34.64±2.18 |
如Fig 2所示，纳米复合物(MSNP-PEI与siRNA 100:1)作用于EC-9706后，纳米复合物组凝胶电泳不显示游离siRNA的荧光亮带；单siRNA组凝胶电泳显示游离siRNA的荧光亮带。
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| Fig 2 Encapsulation efficiency of nanocomposites 1:siRNA; 2:Nanocomposite |
如Fig 3所示，siRNA为100 nmol·L-1的纳米复合物分别作用EC-9706细胞24、48、72 h后，对EC-9706细胞的增殖均有明显的抑制作用，与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。
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| Fig 3 Survival rates of EC-9706 cell action at different time to 100 nmol·L-1 siRNA nanocomposite *P < 0.05 vs control |
EC-9706细胞转染72 h后，对照组和siRNA组不显示绿色荧光，载siRNA的靶向纳米复合物显示明显的绿色荧光，即载siRNA的肿瘤靶向纳米复合物能有效地被EC-9706细胞摄取而进入细胞(Fig 4)。
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| Fig 4 Uptake of siRNA by EC-9706 cells in vitro |
载siRNA的肿瘤靶向纳米复合物作用EC-9706细胞72 h后，Fig 5的RT-PCR扩增产物电泳结果显示，靶向ESCCAL_1的纳米复合物组的ESCCAL_1 LncRNA的表达降低，内参GAPDH mRNA水平几乎没有变化；载siRNA的肿瘤靶向纳米复合物灰度比值为(28.6±2.2)%，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。即载siRNA的肿瘤靶向纳米复合物作用72 h后，EC-9706细胞中ESCCAL_1基因LncRNA的相对表达量明显减少。
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| Fig 5 Effect of nanocomposite on expression of ESCCAL_1 LncRNA in EC-9706 cells *P < 0.05 vs control |
近年来，随着基因组测序等技术的出现，长链非编码RNA逐渐进入了人们的视线，并成了基础研究的热点[8]。Cao等[3]采用LncRNA阵列技术，比较食管鳞状细胞癌与其临近正常组织中LncRNAs的表达差异，选取表达差异达30倍、位于8号染色体的第48号上调LncRNA(chr8:76121095~76189420 reverse strand)，命名为ESCCAL_1(esophageal squamous cell carcinoma associated LncRNA_1)。研究证明ESCCAL_1参与了食管癌的形成过程；敲除ESCCAL_1可增加EC9706细胞凋亡，降低其侵袭力。这些结果表明，ESCCAL_1的表达水平发生异常改变，可能作为食管癌潜在的药物靶点[3-4]。
越来越多的研究表明，单分散介孔氧化硅纳米颗粒(mesoporous silica nanoparticles, MSNs)作为药物载体具有独特优势，已成为近年纳米肿瘤药剂研究的热点。Tsai等[9]以表面活性剂修饰过的MSNs输送白藜芦醇，改善了白藜芦醇的溶解度，增加了人宫颈癌细胞HeLa细胞的内吞药量，提高了该药物的生物利用度。Hom等[10]采用聚乙烯亚胺与MSNs组装，输送siRNA。利用形成的“质子海绵效应”来保siRNA不被核酸酶降解，并减少siRNA引起的非特异性免疫刺激，成功地沉默了胰腺癌细胞Panc-1中Akt或K-ras的表达。Gao等[11]考察不同孔径的空心MSNs载药系统对多柔比星耐药的乳腺癌细胞MCF-7/ADR的杀伤力，发现孔径12.6 nm比3.2 nm的MSNs载药系统有更强大的杀伤作用。中国科学技术大学王均教授课题组与美国Emory大学聂书明教授课题组合作，发明了一种微型“纳米航母”药物递送体系，实现更加精准有效的抗肿瘤药物递送，研究成果发表在《美国科学院院刊》上(PNAS，doi: 10.1073/pnas.1522080113)[12]。本研究使用MSNP-PEI作为ESCCAL_1 siRNA的载体转染EC-9706细胞，沉默ESCCAL_1 LncRNA，通过RT-PCR证明了ESCCAL_1 siRNA能有效下调ESCCAL_1基因的表达，初步验证MSNP-PEI可以作为基因载体的作用。
本研究制备靶向ESCCAL_1基因的siRNA纳米复合物，并考察其在体外对食管癌EC-9706细胞的抑制作用。结果显示，其介导的siRNA能有效抑制食管癌EC-9706细胞的体外增殖、能有效沉默EC-9706细胞中ESCCAL_1 LncRNA。该研究结果为载siRNA的纳米复合物在肿瘤的基因治疗应用上提供了有用的实验依据。我们将进一步深入研究靶向ESCCAL_1基因的siRNA纳米复合物在体内的安全性和有效性。
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