2. 浙江大学医学院 基础医学部, 浙江 杭州 310058
2. Dept of Basic Science of Medicine, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
肺癌和慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)影响人类生活质量，发病率呈现逐年增加的趋势，是有必要关注的全球性健康问题。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肺癌和COPD的重要病理生理过程[1]。吸烟是引起EMT的重要因素[2]，有研究证实，用香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)刺激肺上皮细胞会增加IL-1α、IL-1β、IL-8、TNF-α、MMP-9以及TGF-β1的表达[3-4]。然而，香烟所引起的EMT变化以及其潜在的机制还需进一步研究。Shp2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的一员，参与调控细胞增殖、迁移、分化和代谢转录[5]。EMT是细胞转分化的一种重要形式，提示Shp2在EMT过程中可能也发挥调控作用。在过去的20多年里，转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)已逐渐被明确为最重要的EMT诱导因子，并且成为近年来的研究焦点[6]。有研究证明，Shp2在TGF-β1诱导的EMT中发挥调节作用，但其是否调节香烟诱导的肺泡EMT尚未见报道。在本研究中，我们初步探讨Shp2在CSE诱导的EMT中的调节作用。
1 材料 1.1 细胞株人Ⅱ型肺泡上皮细胞株A549细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
1.2 药物与试剂Shp2抑制剂苯基吡唑肼基磺酸盐(phenylhydrazonopyrazolone sulfonate 1，PHPS1)购自美国Sigma公司；3R4F标准香烟购自美国肯塔基大学烟草研究所；荧光二抗购自LiCOR公司(批号: 926-32211)；兔抗人E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波纹蛋白(Vimentin)、α-肌动蛋白(α-SMA)、p-Smad2、Smad2均购自Cell Signaling公司；Shp2 siRNA购自上海吉玛公司；DMEM培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；TGF-β1酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；其他制剂均为市售AR级试剂。
1.3 仪器CO2细胞培养箱:美国Thermo公司；BX51显微镜:日本Olympus公司；7300实时荧光定量PCR仪:美国ABI公司；Biophotometer核酸蛋白紫外分光光度计:德国Eppendorf公司；IX70倒置显微镜:日本OLYMPUS公司；AG22331核酸蛋白测定仪:德国Eppendorf公司；酶标仪:美国ThermoFisher Scientific；Odyssey红外荧光扫描成像系统:美国基因公司。
2 方法 2.1 细胞培养A549细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养基(含2 mmol·L-1谷氨酰胺、10 kU·L-1青霉素、10 mg·L-1链霉素)中，37℃、5% CO2条件下常规培养，观察细胞生长情况，每2 d传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。
2.2 CSE制备CSE的制备参考Baginski等[7]报道的方法并加以修改。收集3支实验研究用的滤嘴香烟(3R4F标准香烟，每支焦油含量9.5 mg，尼古丁含量0.73 g)，用50 mL针筒抽吸入30 mL PBS中。香烟持续抽吸4 min。1支香烟抽吸完毕后，溶液用1 mol·L-1氢氧化钠(市售分析纯)调整pH值至7.2~7.4，然后经含0.45 μm微孔滤膜的滤头过滤除菌，在320 nm检测吸光度定标。CSE在-80℃保存，使用前应快速解冻，30 min内用于实验。
2.3 Q-PCR检测TGF-β1的表达取指数生长期的A549细胞制成单细胞悬液，以2×105个/瓶的密度接种于12.5 mL培养瓶中，待细胞覆盖培养瓶80%以上，用PBS洗1次，彻底去除血清作用，换用0.1% BSA的DMEM培养基继续培养过夜。药物孵育48 h后，提取细胞的mRNA，以逆转录的cDNA为模板，以GAPDH上游序列:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游序列:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′作为内参；用目的基因TGF-β1引物上游序列: 5′-CCAGGACGCCTTCTGCAAC-3′，下游序列: 5′-CCTCCTTTACCAGCTTCTTCCC-3′进行荧光定量PCR分析。
2.4 酶联免疫吸附法(ELISA)检测A549细胞接种于12孔板，每孔培养基总量1 mL, 各组细胞于加药刺激后留取细胞培养上清，分别用于检测TGF-β1的蛋白表达。ELISA检测细胞上清液中TGF-β1的蛋白含量，操作步骤按试剂盒说明书进行。
2.5 免疫荧光染色A549细胞接种在盖玻片上，放入12孔板中培养，各组细胞于加药刺激后PBS洗3遍，弃PBS后加入4%多聚甲醛固定0.5 h。然后用0.1% (V/V) Triton X-100/PBS通透0.5 h，1% BSA (W/V)/1%正常血清(V/V)/PBS在常温下封闭1 h。弃封闭液，孵一抗(1:50，PBS稀释)，4℃冰箱放置过夜，洗片，然后用荧光二抗(1:200，PBS稀释)在常温下孵育2 h。洗片后DAPI染核。用50%甘油进行封片，于共聚焦显微镜下观察染色情况。
2.6 Western blot检测将对数生长期的细胞，每孔106个接种于6孔板，药物预处理0.5 h，加CSE刺激0.5 h后，收集细胞，裂解液裂解细胞，4℃、12 000 r·min-1离心10 min，获得蛋白样品。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。蛋白变性后，30~50 ng蛋白样品上样，十二烷基硫酸钠凝胶电泳2 h，湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗(1:500)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗(1:5 000 HRP标记的羊抗兔IgG)室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，以Odyssey荧光扫描仪扫描，采用Quantity one软件计算灰度比值。
2.7 细胞Shp2基因转染A549细胞培养于6孔板中，生长24 h后，根据说明书用Lipofectamine 2000试剂将携带Shp2 siRNA序列(正义链5′-GAACAUCACGGCAAUUAAUU-3′，反义链5′-GAACACUGGUGAUUACUAUUU-3′)和空载体转入到A549细胞中。转染48 h后，用免疫印迹法检测细胞中Shp2蛋白表达。
2.8 统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。结果以x±s表示，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)对各项指标进行组间比较，组间差异用LSD检验。
3 结果 3.1 CSE对Shp2表达及活性的影响为确定CSE对肺上皮细胞Shp2表达的影响，Ⅱ型肺泡上皮细胞A549在2% CSE培养液中培养6 h，Western blot结果显示，与未处理空白组相比，CSE刺激组Shp2明显过表达(Fig 1A)。CSE刺激A549细胞15 min后, Western blot法测定Shp2磷酸化水平，如Fig 1B显示，CSE呈浓度依赖性诱导A549细胞Shp2磷酸化。
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| Fig 1 Stimulation of CSE increases Shp2 level and phosphorylation in A549 cells (x±s, n=4) *P < 0.05 vs untreated control group |
PHPS1(20 μmol·L-1)预处理细胞0.5 h后，加2% CSE刺激细胞48 h后，采用Q-PCR和ELISA法测定TGF-β1 mRNA和蛋白的表达。Fig 2结果显示，PHPS1抑制CSE诱导的TGF-β1 mRNA和蛋白的表达。
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| Fig 2 Inhibition of Shp2 reduces expression of TGF-β1 mRNA(A) and protein(B) induced by CSE in A549 cells(x±s, n=4) **P < 0.01 vs untreated group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs CSE-stimulated group |
采用显微镜观察PHPS1对CSE诱导的肺上皮细胞形态的影响。结果显示，与空白对照组相比(Fig 3A)，CSE刺激A549细胞48 h后，细胞的形态发生改变(Fig 3B)。在加CSE刺激之前，PHPS1 (20 μmol·L-1)预处理30 min，能改善CSE诱导的细胞形态改变(Fig 3C)。而PHPS1 (20 μmol·L-1)单独处理细胞对细胞的形态没有明显的影响(Fig 3D)。
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| Fig 3 Effect of PHPS1 on CSE-induced variation of cell morphology in A549 cells A: Control; B: 2% CSE; C: 2% CSE + PHPS1; D: PHPS1 |
免疫荧光染色A549细胞，Fig 4结果表明，与空白对照组相比，2% CSE刺激组EMT相关因子E-cadherin表达(绿色荧光)减少，Vimentin和α-SMA表达增加；预先用PHPS1(20 μmol·L-1)处理能明显增加E-cadherin表达，减少Vimentin和α-SMA表达。该结果提示抑制Shp2能有效减少CSE诱导EMT相关因子的表达。
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| Fig 4 Inhibition of Shp2 regulates expression of EMT-related factors induced by CSE in A549 cells (x±s, n=4) A: Representative photomicrographs demonstrating E-cadherin, Vimentin and α-SMA detected by immunofluorescence staining(scale bar: 200 μm). B:Fluorescent quantitative results. *P < 0.05, **P < 0.01 vs untreated group; #P < 0.05 vs CSE-stimulated cells. |
PHPS1(20 μmol·L-1)抑制Shp2的活性，然后用2% CSE刺激细胞0.5 h，Western blot法检测Smad2的磷酸化。如Fig 5A所示，PHPS1明显抑制CSE诱导的Smad2的激活。进一步采用Shp2 siRNA抑制Shp2的表达，Fig 5B结果显示，阻断Shp2的表达可明显抑制CSE诱导的Smad2的磷酸化。
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| Fig 5 Inhibition of Shp2 inhibitor(A) or Shp2 siRNA(B) alleviates Smad2 phosphorylation induced by CSE in A549 cells (x±s, n=4) Cell lysates were prepared, and then immunoblotted with antibodies for phospho-Smad2 phosphorylated at Ser465/467. *P < 0.05 vs untreated group/negative control (NC) group; #P < 0.05 vs 2% CSE group. |
肺癌和COPD是常见病，在有些病人也是共患病[1]，晚期均有不同程度的肺纤维化[8]。肺纤维化发病机制较复杂，迄今为止尚未完全阐明。在COPD，EMT参与组织修复和重塑的过程会导致小气道纤维化；在肺癌，EMT除了促进肿瘤细胞的转移，也会引起肺纤维化[1]。
吸烟是引起肺纤维化的重要因素。机体吸入香烟烟雾之后将会改变其生理机制。Araya等[9]的研究发现，COPD患者的鳞状气道上皮细胞分泌的IL-1β可以促进气道成纤维细胞胶黏蛋白的表达，这主要是通过成纤维细胞αvβ8的过表达以及后续TGF-β的激活。因此，我们推测肺上皮细胞分泌的细胞因子和趋化因子可能会触发TGF-β的激活。
TGF-β1是调节EMT的一种重要信号元素，了解TGF-β1在EMT中的具体信号机制将有助于减轻纤维化，同时保留TGF-β1在体内重要的平衡功能[10]。Shp2有多种调节功能，如骨架重排、转录和细胞增生[11]。Shp2正向调控成纤维细胞的黏附和迁移，Shp2纯合突变的成纤维细胞的伸展和迁移能力降低[12]。Shp2特异性抑制剂PHPS1可缓解吸烟引起的炎症反应，抑制多种肿瘤细胞的增殖，其简单的化学结构及较好的药效为临床治疗与Shp2相关疾病提供了新的手段[3]。近年来有文献报道称，阻断Shp2能抑制TGF-β1诱导的EMT[13]。在本实验中，我们发现用CSE刺激肺泡上皮细胞可以激活Shp2, 促进TGF-β1的表达。进一步研究相关的机制，我们探索Shp2特异性抑制剂PHPS1是否能阻断TGF-β1的上调，从而抑制CSE诱导的EMT。本研究结果显示，PHPS1能抑制TGF-β1的上调，并且反转CSE刺激后EMT相关因子的变化。我们推测Shp2可能是众多EMT刺激剂的下游信号靶点。
正如以往报道的，EMT的形成依赖Smad信号途径的激活[14]。且已有研究证明，抑制Smad2的活性或表达可以明显抑制CSE诱导的EMT相关因子的表达变化[15]。本研究结果显示，用CSE刺激肺泡上皮细胞能激活Smad2信号通路。值得注意的是，抑制Shp2的活性或表达可抑制Smad2的激活。本研究发现，CSE诱导的EMT可能经过TGF-β1/Shp2/Smad2信号途径，为深入研究肺纤维化的发病机制奠定了基础。本研究初步探讨了Shp2对香烟诱导的EMT的调节作用，结果提示Shp2可能是治疗COPD和肺癌的一个新靶点。
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