2. 延边大学附属医院 中心实验室，吉林 延吉 133000
2. Central Lab, Affiliated Hospital of Yanbain University, Yanji Jilin 133000, China
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)性疾病属于危及人类健康的重大疾病之一[1-5]，内皮细胞损伤、凋亡是AS病变形成的始动环节，脂质代谢紊乱是导致AS发生的独立危险因素之一[6]，降低脂质、保护血管内皮是AS性疾病防治的关键步骤。有关AS发生机制的炎症学说认为，AS是一个血管受损伤后的慢性炎症过程，各种炎症因子在动脉中的浸润和过量表达可以促进AS的发生、发展[7]。研究发现，导致心肌梗死的AS不稳定性斑块的两个主要特征是斑块中大量的炎症因子浸润和丰富的游离胆固醇。大量研究证实，内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可能参与了AS的炎症反应的病理过程，ERS途径可能是一种广泛的血管炎症和内皮功能障碍的调节因素[8]。可见，ERS与血管内皮细胞损伤有一定关联，但是ERS与脂毒性血管内皮损伤之间的相关性研究甚少。基于此，本研究拟分析棕榈酸对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的ERS信号通路活性及细胞凋亡的影响，阐明ERS信号通路与棕榈酸所致血管内皮细胞凋亡的关联，将为脂毒性内皮损伤的防治提供指导意义。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞系HUVECs购自上海基免实业有限公司。
1.1.2 试剂GRP78、CHOP、PERK、IRE1、ATF6抗体均购自美国Abcam公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自BestBio(贝博)公司；CCK-8检测试剂盒购自碧云天公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶均购自美国Gibco公司；棕榈酸(palmitic acid，PA)及ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)均购自Sigma公司。
1.1.3 仪器超净工作台(上海博讯实业有限公司)，二氧化碳培养箱(杭州利辉环境检测设备有限公司)，荧光显微镜及倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)，紫外分光光度计(上海凌析仪器有限公司)，多功能酶标仪(上海逍鹏生物科技有限公司)，高速冷冻离心机(德国Sigma公司)，电泳槽、电转膜仪(Bio-Rad公司)，化学发光凝胶成像系统(美国ProteinSimple公司)。
1.2 方法 1.2.1 游离脂肪酸的配制用0.1 mol·L-1的NaOH溶液在70℃水浴中溶解一定量的PA，振荡混匀10 min，过滤，配成100 mmol·L-1的PA储存液。在55℃水浴中，用去离子水配50 g·L-1的BSA溶液，过滤。将上述PA溶液和BSA溶液按1:19的体积比混合配成PA/BSA复合液，在水浴中振荡10 s，继续水浴10 min，取出后冷却至室温，过滤。然后，将上述复合液分别用高糖DMEM培养基稀释。
1.2.2 细胞培养HUVECs在细胞培养箱(饱和湿度、5% CO2、37℃)中培养至70%~80%融合度，经消化、传代，进行实验。采用的DMEM培养液包含10 mL·L-1双抗、2 mmol·L-1的L-谷氨酰胺、10 mmol·L-1的HEPES、10 mmol·L-1的丙酮酸钠、5 mmol·L-1葡萄糖。
1.2.3 实验分组① PA浓度梯度分析实验：对照组、PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)组。② PA(0.4 mmol·L-1)时间梯度分析实验：对照组、12 h刺激组、24 h刺激组、48 h刺激组。③抑制剂实验：对照组、0.4 mmol·L-1 PA组、10 mmol·L-1 4-PBA预处理2 h后，给予0.4 mmol·L-1 PA组。
1.3 检测指标 1.3.1 CCK-8检测细胞增殖率HUVECs接种于96孔培养板中(每孔1×106个细胞)，培养24 h后给药，进行孵育，每孔中加入10 μL CCK-8溶液反应2 h，酶标仪检测570 nm处吸光度值。按公式：细胞增殖抑制率/%=(对照组吸光度值-给药组吸光度值)/(对照组吸光度值-本底)×100%计算，共重复3次，每组6个复孔。
1.3.2 Western blot法检测ERS信号通路蛋白表达水平每组血管内皮细胞在细胞培养箱内培养过夜后，用PBS清洗2次，按组别给药后，培养箱内孵育一定时间，在4℃用裂解液裂解细胞30 min后，用细胞刮将培养板内细胞反复刮至离心管内，13 000 r·min-1离心分离15 min，蛋白定量后，取20 μL的蛋白样品加入SDS-PAGE凝胶样品槽内，经电泳、转膜、封闭等过程后，加入GRP78、CHOP、PERK、IRE1、ATF6抗体(均为1:1 000)，4℃孵育24 h，洗膜，加入二抗室温反应1 h后，用显影液处理，用化学发光凝胶成像仪分析NADPH信号通路蛋白表达水平。
1.3.3 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。凋亡中晚期碘化丙啶(propidium Iodide，PI)能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI则被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。6孔细胞培养板接种HUVECs，当细胞贴壁生长至70%~80%融合度，按组别给药后，培养箱内孵育24 h，PBS反复冲洗后，加入500 μL的1×Binding Buffer，加入5 μL的Annexin V-FITC避光室温孵育15 min，再加入5 μL的PI孵育5 min，PBS反复冲洗后，采用荧光显微镜拍照，并用Image J 1.41软件分析绿色荧光强度。
1.4 统计学方法数据以x±s表示，统计学分析采用GraphPad软件，采用单因素方差分析进行组间比较，两组比较采用成组设计资料t检验。
2 结果 2.1 棕榈酸对HUVECs细胞增殖的影响Fig 1A结果表明，0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1PA组在PA刺激24 h后，0.4、0.8 mmol·L-1 PA组的血管内皮细胞增殖率明显降低(P < 0.05)。Fig 1B结果表明，0.4 mmol·L-1 PA刺激0、12、24、48 h后，刺激时间在24~48 h时，血管内皮细胞增殖率明显降低(P < 0.05)。
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| Fig 1 Influence of PA on cell viability in HUVECs (x±s, n=5) A: Cell viability was significantly suppressed when PA concentration increased to 0.4 mmol·L-1; B: HUVECs were treated with 0.4 mmol·L-1 PA for different time, and inhibition of cell viability was calculated from CCK-8 assay. *P < 0.05 vs 0 mmol·L-1 group (A); #P < 0.05 vs 0 h group (B). |
如Fig 2所示，0.4 mmol·L-1 PA刺激0、12、24、48 h后，刺激时间在24~48 h，GRP78、CHOP、PERK、IRE1、ATF6等ERS信号通路蛋白的水平出现高表达状态(P < 0.05)；而24、48 h PA刺激组之间的ERS信号通路蛋白表达均无显著性差异(P > 0.05)。
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| Fig 2 Influence of PA(0.4 mmol·L-1)on expression of ERS in cell viability in HUVECs (x±s, n=3) A: Representative images of GRP78, CHOP, PERKphos, IRE1phos and ATF6 expression by Western blot; B: HUVECs were treated with 0.4 mmol·L-1 PA for different time, and quantitative analysis of GRP78, CHOP, PERKphos, IRE1phos and ATF6 expression. *P < 0.05 vs 0 h group. |
如Fig 3所示，0.4 mmol·L-1 PA刺激0、12、24、48 h后，24、48 h组的红色荧光明显强于0、12 h组，说明刺激24~48 h时细胞出现明显凋亡状态，而24、48 h PA刺激组之间的红色荧光水平无显著性差异。
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| Fig 3 Effects of PA(0.4 mmol·L-1)on apoptosis of HUVECs (scale bars: 50 μm) Annexin V-FITC is green fluorescence; PI is red fluorescence. Fluorescence images of HUVECs stained with(Annexin V-FITC)/PI after cells were incubated for 0 h (A), 12 h (B), 24 h (C) and 48 h (D) with 0.4 mmol·L-1 PA. |
如Fig 4所示，0.4 mmol·L-1 PA刺激24 h后，细胞出现明显凋亡状态；而与单纯PA(0.4 mmol·L-1)组相比，预处理内质网应激抑制剂4-PBA组细胞凋亡明显减少，与对照组无显著性差异。
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| Fig 4 Influence of ERS inhibitor 4-PBA on apoptosis of HUVECs exposed to PA(scale bar: 50 μm) Fluorescence images of HUVECs stained with(Annexin V-FITC)/PI after cells were incubated for 24 h with control (A), 0.4 mmol·L-1 PA (B) and 0.4 mmol·L-1 PA+10 mmol·L-1 4-PBA (C). |
1847年，胆固醇被鉴定为AS斑块中的关键组成部分，继而脂质浸润学说被认为是由于血脂升高导致AS的重要学说。此学说主张，一般生理状态下，血管内皮设有屏障，使脂蛋白颗粒进入动脉受阻，而在高血脂等病理状态下，血管壁局部上沉积胆固醇等脂质，从而诱发平滑肌细胞和单核/巨噬细胞聚集被细胞吞噬而出现泡沫细胞，细胞间质增多，血管内膜增厚，最终出现AS。可见，脂质浸润与血管内皮损伤有密不可分的关联，因此，本研究建立了棕榈酸所致血管内皮细胞损伤模型，旨在模拟脂毒性AS体系。本研究结果显示，棕榈酸刺激血管内皮细胞时，细胞增殖功能出现明显降低，此结果符合文献报道。
内皮细胞凋亡是AS的起始阶段，研究表明ERS信号通路对AS疾病中内皮细胞功能紊乱起着广泛的调节作用[9]。内质网属于真核细胞较关键的细胞器，主要发挥包括合成胆固醇和脂质、合成蛋白质、调节钙等作用[10-14]。内质网是真核细胞中蛋白质翻译合成和细胞内钙离子存储场所，新生的蛋白质在分子伴侣的协助下进行折叠，只有正确折叠的蛋白质可以被转运到高尔基体，未折叠或者错误折叠的蛋白仍留在内质网，通过内质网相关降解机制逆移位至细胞质，并被蛋白酶体降解[15]。近年研究发现，脂质过度负荷可打破内质网的稳态，这种内质网功能紊乱时出现错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态被称为ERS。为了减轻ERS，真核细胞激活一系列自身保护机制，称为ERS反应，即从内质网向核内的信号传导，而目前，ERS信号传导主要涉及3个内质网跨膜效应蛋白：PERK、IRE1和ATF6。正常情况下，这3种蛋白的内质网腔内侧都与GRP78/BIP结合而处于无活性状态，当内质网腔内未折叠蛋白或错误折叠蛋白聚集超过内质网处理能力时，GRP78/BIP即从这3种蛋白解离，与未折叠蛋白或错误折叠蛋白结合，以协助其正确折叠，GRP78/BIP解离时PERK、IRE1、ATF6三个反应器蛋白出现活化，进而触发ERS的信号传导。如果ERS时间过长，3个内质网跨膜效应蛋白持续表达也会上调凋亡相关的基因，如转录因子CHOP的表达，促使细胞凋亡。本研究提示，棕榈酸刺激血管内皮细胞24 h后，ERS信号通路蛋白GRP78、PERK、IRE1、ATF6、CHOP的表达明显升高，说明ERS信号通路的激活可能与棕榈酸诱导的血管内皮细胞损伤有密切关联。而另一组研究提示，棕榈酸刺激24 h时血管内皮细胞凋亡水平出现明显升高，而与单纯棕榈酸组相比，预处理ERS抑制剂4-PBA组细胞凋亡明显减少。此现象说明血管内皮细胞可在棕榈酸的刺激下出现明显的细胞凋亡，且此损伤与ERS信号通路的激活密切相关。
综上所述，棕榈酸刺激可抑制血管内皮细胞的增殖能力，激活ERS信号通路，使细胞处于应激性凋亡状态，而此状态成功被ERS信号通路抑制剂所阻断。此结果证实，调控ERS信号通路对棕榈酸引起的血管内皮细胞损伤的防治有指导意义。
( 致谢: 本文实验主要在延边大学基础学院药学分析实验室、基础学院药理学实验室、附属医院中心实验室完成，由湖北科技学院医药研究院省重点实验室协助完成。感谢廉丽花副教授、李晶副教授、硕士生马伟平、金艳红、权丽娜等对本实验的指导与帮助。)
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