2. 桂林医学院 附属医院感控科, 广西 桂林 541004
2. Dept of Infection Control, Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin Guangxi 541004
表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)为绿茶中的抗氧化活性成分[1]，具有清除氧自由基、抗肿瘤等多种生物学活性。有文献报道[2]，EGCG为肿瘤多药耐药逆转剂，可逆转肿瘤的多药耐药。近期研究发现[3]，EGCG可通过激活PI3K/Akt通路来减少心脏、肾脏、肠等缺血/再灌注损伤，但是EGCG的上述研究大多是体内研究，体外研究少有报道。因此，本实验以大鼠H9c2心肌细胞为研究对象，探讨EGCG对心肌细胞缺氧/复氧损伤的抑制作用及机制。
1 材料 1.1 细胞株与分组H9c2心肌细胞株，购自中科院上海细胞库。细胞培养融合至80%~90%后，将培养的H9c2心肌细胞随机分为5组：正常对照组(Normal组)、缺氧/复氧组(H/R组)、EGCG 12 mg·L-1组(L组)、EGCG 18 mg·L-1组(M组)、EGCG 24 mg·L-1组(H组)。
1.2 药物EGCG购自美国Sigma公司，批号：E4 143，纯度≥95%。
1.3 试剂与仪器DMEM培养液(Gibco，货号：116467)；特级胎牛血清(四季青，货号11011-8611)；CCK-8试剂盒(日本同仁，批号：CK04)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(广州BD生物科技有限公司，批号：35562)；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)试剂盒(达科维公司，批号：E3720-1207-2)；总抗氧化力(total antioxidant capacity，T-AOC)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：A015)；Akt和p-Akt抗体(CST公司，批号：4685和4060)；逆转录试剂盒(Invitrogen，批号：CKD8025032)。CO2孵箱(日本SANYO公司，型号：MCO-15AC)；酶联免疫检测仪(瑞士TECAN公司，型号：Infinite M200 PRO)；流式细胞仪(美国BD公司，型号：Accuri C6)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司，型号：ChemiDocTMXRS+)；荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司，型号：CFX96TM Real-Time System)等。
2 方法 2.1 模型建立预先用高纯氮气(999 mL·L-1)饱和无糖DMEM液，通气持续时间≥40 min, 即为低氧液；用高纯氧(999 mL·L-1)饱和高糖DMEM液，通气持续时间≥40 min，即为复氧液。细胞培养融合至80%~90%后，用低氧液置换正常培养液，并将培养板置于密封保鲜袋中，充入高纯氮气造成缺氧培养环境, 封口培养4 h；4 h后，以复氧液置换低氧液，排出氮气并充以高纯氧，继续培养4 h即为心肌细胞复氧。除Normal组和H/R组外，各组细胞均于造模前4 h加入相应药物预处理。
2.2 测定指标 2.2.1 CCK-8法测定细胞存活率取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔细胞数约5 000个，将培养板在培养箱预培养(37℃，95%空气+5% CO2)，待细胞融合至80%~90%后进行处理。每个实验组的处理按照上述对应建模方法，每组设6个复孔。细胞处理结束后，按CCK-8试剂盒说明书操作，重复测定3次。
2.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡按不同的实验要求处理细胞后，按照凋亡试剂盒说明书操作，并用Flowjo 7.6软件处理分析，计算细胞凋亡率。
2.2.3 细胞培养液T-AOC、TNF-α含量测定按不同的实验要求处理细胞后，按照试剂盒说明书检测细胞培养液中T-AOC及TNF-α的含量。
2.2.4 Western blot法检测p-Akt及Akt蛋白表达按不同的实验要求处理细胞后，用蛋白提取试剂盒按操作说明提取细胞总蛋白，以BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，煮沸变性，SDS-PAGE凝胶电泳。电转移至硝酸纤维素(PVDF)膜上，5% BSA封闭2 h，用TBST清洗3次，分别加入p-Akt、Akt抗体(1：1 000)，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，加入相应二抗室温孵育1 h，TBST清洗3次，ECL显色。将PVDF膜放入凝胶扫描系统曝光及图片扫描成像。采用ImageJ软件计算分析各蛋白条带和对应的内参蛋白(GAPDH)条带的灰度。
2.2.5 qRT-PCR法检测PI3K、Akt、caspase-3基因表达细胞造模结束后，使用TRIzol法提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书，使RNA反转录成cDNA。荧光实时定量PCR为20 μL反应体系：power SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 5 μL，双蒸水3 μL。反应条件为：95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40个循环。根据比较法计算基因表达相对量。采用公式2-ΔΔCt计算基因表达的相对倍数变化。引物序列见Tab 1。
| Gene | Sequence |
| GAPDH | Forward 5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′ |
| Reverse 5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT -3′ | |
| PI3K | Forward 5′-CGGTGATGTGCTAGAAGCAA-3′ |
| Reverse 5′-TCCGTGTCTCCATCTCAGTG-3′ | |
| Akt | Forward 5′-ACTCATTCCAGACCCACGAC-3′ |
| Reverse 5′-ACACAATCTCCGCACCGTA-3′ | |
| Caspase-3 | Forward 5′-ACGATCCACCAGCATTTGTT-3′ |
| Reverse 5′-CAATTTGAGGCTGCTGCATA-3′ |
数据以x±s表示，采用SPSS 21.0统计软件，单因素方差分析进行组间比较。
3 结果 3.1 EGCG对H9c2心肌细胞H/R损伤后存活率的影响如Fig 1所示，H/R组细胞存活率明显降低(P＜0.05)；EGCG预处理可以增加H/R损伤细胞的存活率，且EGCG浓度为18 mg·L-1时效果最好(P＜0.05)。
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| Fig 1 Effect of EGCG on survival rate of H9c2 cardiac myocytes exposed to hypoxia/reoxygenation *P < 0.05 vs N group; #P < 0.05 vs H/R group |
Fig 2结果显示，正常组心肌细胞凋亡不明显(凋亡率＜5%)，H/R后心肌细胞凋亡率明显升高(P＜0.05)；3个剂量的EGCG均能减少心肌细胞的凋亡率(P＜0.05)，且中剂量组效果最明显。
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| Fig 2 Effect of EGCG on apoptotic rate of H9c2 cardiac myocytes exposed to hypoxia/reoxygenation *P < 0.05 vs N group; #P < 0.05 vs H/R group |
由Tab 2可见，H/R组心肌细胞上清液T-AOC明显降低，且TNF-α含量明显增高(P＜0.05)；给药组3个剂量均能增加T-AOC，减少TNF-α(P＜0.05)，其中中剂量组效果最明显。
| Group | Dose/mg·L-1 | T-AOC/kU·L-1 | TNF-α/ng·L-1 |
| N | - | 19.29±1.68 | 85.86±6.12 |
| H/R | - | 10.21±0.90* | 131.02±7.28* |
| L | 12 | 13.63±0.66# | 68.23±6.25# |
| M | 18 | 16.87±0.27# | 45.07±7.78# |
| H | 24 | 17.20±0.80# | 69.93±3.51# |
| *P < 0.05 vs N group; #P < 0.05 vs H/R group | |||
如Fig 3所示，与正常组相比，H/R组p-Akt/Akt的水平明显降低(P＜0.01)；与H/R组相比，给药组3个剂量均能增加p-Akt/Akt的水平(P＜0.05)，中剂量组p-Akt/Akt水平增加最明显。
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| Fig 3 Effect of EGCG on expression of p-Akt/Akt of H9c2 cardiac myocytes exposed to hypoxia/reoxygenation **P < 0.01 vs N group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs H/R group |
如Fig 4所示，与正常组相比，H/R组PI3K、Akt的mRNA表达水平明显降低(P＜0.05)；给药组均能增加PI3K、Akt的mRNA表达水平(P＜0.05)，其中中剂量EGCG组增加最明显。H/R时，caspase-3的mRNA表达水平明显升高(P＜0.05)；给药组均能降低caspase-3的mRNA表达水平(P＜0.05)，其中中剂量减少最明显。
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| Fig 4 Effect of EGCG on mRNA levels of PI3K, Akt and caspase-3 of H9c2 cardiac myocytes exposed to hypoxia/reoxygenation *P < 0.05 vs N group; #P < 0.05 vs H/R group |
心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)指在短时间内中断心肌血供，且在短时间内恢复血供。较血供恢复前，原缺血心肌在代谢、结构、功能等方面发生更严重甚至不可逆损伤，其发病机制复杂，涉及多种生物活性分子和细胞内信号转导通路，例如活性氧、钙超载、细胞凋亡、炎症反应、线粒体渗透性转换孔道的开放等[4]。
在MIRI发生时，细胞内氧自由基增多以及心肌抗氧化能力降低[5]。抗氧化能力对机体防御反应至关重要，总抗氧化能力的强弱直接影响心肌细胞的生存状态。因此，总抗氧化力的强弱可反映心肌细胞受损伤的程度。本实验中模型组心肌细胞T-AOC明显降低，而EGCG预处理则可增强T-AOC，提高心肌细胞的存活率。文献报道[6]，EGCG在低浓度时对细胞没有损伤，但在高浓度时会抑制细胞的增殖。本研究结果表明，中剂量(18 mg·L-1)EGCG预处理效果最好，EGCG抑制心肌细胞损伤的最佳浓度还有待进一步研究。
细胞凋亡是导致MIRI的一个重要因素，主要包括死亡受体、线粒体、内质网应激3种凋亡途径[7]。死亡受体途径又称外源性凋亡途径，由细胞外信号导致。死亡受体是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族中的一个亚家族[8]，TNFR-Ⅰ和TNFR-Ⅱ为肿瘤坏死因子受体家族中的两个受体亚型，可以介导细胞凋亡[8-9]。TNFR-Ⅰ三聚体化后，同死亡区的肿瘤坏死因子受体1相关蛋白抗原衔接，进一步与Fas相关死亡域蛋白结合，激活caspase途径，诱导细胞凋亡的产生；TNFR-Ⅱ被激活，随后激活NF-κB，NF-κB的抑制能够减少炎症因子TNF-α的释放，减少细胞凋亡[10]。本实验结果显示，正常组细胞培养上清液TNF-α的含量很低，而模型组的TNF-α含量明显上升，H/R损伤后有大量的细胞凋亡，EGCG预处理组可明显降低TNF-α含量，降低心肌细胞凋亡率。提示EGCG减少H/R损伤心肌细胞凋亡可能是通过外源性凋亡途径，减少TNF-α的释放而发挥作用。
线粒体凋亡是细胞凋亡的另一条重要途径，又称为内源性凋亡途径。细胞色素C(cytC)在ATP/dATP存在的情况下，与凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1) 形成多聚复合体，活化caspase-9，进一步活化caspase-3[11]。Caspase-3是caspases家族中重要的凋亡执行者之一，是激活各种凋亡刺激因子的关键蛋白酶，在细胞凋亡过程中起关键作用[12]。本研究结果显示，EGCG减少caspase-3基因表达，提示EGCG可能通过内源性凋亡途径抗细胞凋亡。
PI3K/Akt信号通路是一条重要的抗凋亡/促增殖信号途径。心肌缺血/再灌注时，激活PI3K/Akt通路，Akt在Ser473位点磷酸化变成p-Akt，作用于多个下游靶点，通过调控凋亡蛋白如caspase家族、控制代谢等多种方式促进抗凋亡机制的活化，增加细胞存活，降低MIRI的发病率及死亡率。大量文献表明，激活PI3K/Akt信号通路在抗凋亡过程中起关键作用[13]。课题组前期研究亦发现，EGCG通过影响PI3K/Akt信号通路，抑制细胞凋亡，减少再灌注期过度自噬，对MIRI大鼠起保护作用[14]。本实验结果亦显示，H/R组中PI3K mRNA表达以及p-Akt蛋白表达明显减少，给药组增加PI3K及p-Akt的表达。EGCG干预可通过影响PI3K/Akt信号通路、外源性及内源性细胞凋亡途径，减少心肌细胞凋亡，对心肌细胞H/R损伤产生抑制作用，具体的分子机制还需进一步的实验验证。
综上所述，EGCG预处理可提高心肌细胞总抗氧化力，减少TNF-α释放和caspase-3蛋白的表达，影响PI3K/Akt信号通路，减少心肌细胞凋亡，提高心肌细胞H/R损伤的存活率，保护心肌细胞。
( 致谢: 本实验在桂林医学院科学实验中心及药理实验室完成，感谢各位老师和同学的帮助。)
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