炎性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)为肠道炎症性疾病，表现为正常通过肠道的内容物即可刺激肠黏膜屏障，诱发黏膜免疫功能失调，伴随反复发作的慢性炎症性反应，临床分型主要包括克罗恩病(Crohn′s disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)[1]。随着生活水平的提高，IBD在我国的发病率以及确诊率近些年来明显增加[2]。IBD可影响青少年身体发育，中重度结肠炎患者结肠癌罹患率明显增加，严重危害人们健康[1]。IBD的具体病理机制尚未阐明，研究表明肠道黏膜屏障功能紊乱是IBD非常重要的病理机制之一，维持黏膜屏障的稳定性对于IBD症状的缓解以及治疗具有重要的意义[3]。
芍药汤是中药中对肠道炎症性疾病具有治疗作用的经典中药复方，芍药是芍药汤中一味重要的中药[4]。芍药苷是芍药中的主要活性组分之一，分子式C23H28O11，分子质量为480.4[5-6]。芍药苷具有广泛的药理学活性，比如降血糖、免疫调节、抗肿瘤等[7]。鉴于芍药汤对IBD良好的治疗作用，本文拟考察作为芍药汤中重要组分的芍药苷，对肠上皮细胞屏障功能的保护作用，初步探索其相应的机制。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)是肠道上皮细胞增殖和凋亡的主要促炎因子，是IBD发生的重要致病因子。因此，本研究通过考察芍药苷的安全使用剂量，观察其对TNF-α所致Caco-2模拟肠上皮细胞屏障功能损伤的缓解作用，考察芍药苷对肠上皮细胞紧密连接功能紊乱的致病因子——肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)的影响，以探究芍药苷对上皮细胞屏障功能损伤保护作用的机制。
1 材料 1.1 细胞人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞购自中国科学院上海细胞所。
1.2 试剂芍药苷(纯度≥98%)购自阿拉丁试剂有限公司；TNF-α购自Sigma公司；抗MLCK抗体、紧密连接蛋白occludin与ZO-1抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，均购自武汉三鹰生物技术有限公司；细胞转染试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.3 仪器上海精科紫外可见分光光度计；蔡司倒置显微镜；电泳仪、转膜仪等购自大连捷迈步；美国Millipore Millicell-ERS细胞电阻仪。
2 方法 2.1 细胞培养Caco-2细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液培养，其中含105 U·L-1青霉素、105 U·L-1链霉素。于37℃、5% CO2培养箱内培养Caco-2细胞，待细胞覆盖80%，采用胰蛋白酶消化细胞，制备成细胞悬液，根据具体实验要求，改变相应密度，接种于培养板中，进行后续研究。
2.2 MTT检测芍药苷对Caco-2细胞的作用首先考察芍药苷对正常Caco-2细胞活力的作用，借此选择合适的药物浓度进行后续研究。收集对数生长期的Caco-2细胞，在96孔板中，给予不同终浓度的芍药苷(5、10、20、40、80、160 μmol·L-1)分别处理24 h后，弃上清，PBS洗涤各孔3次。弃去PBS，更换成MTT(5 mg·L-1)工作液100 μL，孵育4 h后，加入100 μL DMSO，微孔振荡器上震荡10 min，用酶标仪检测570 nm下的吸光度值。细胞生存率/%=各组吸光度值/空白组吸光度值×100%。
2.3 Caco-2细胞屏障跨膜电阻测定[8]Caco-2单层细胞于Transwell小室内培养，采用欧姆表检测小室内外两侧电阻差值即为跨膜电阻(transmembrane resistance，TER)。Caco-2细胞培养20 d后，跨膜电阻电阻差值稳定，大约为300 Ω/cm2左右。用跨膜电阻来表征肠上皮屏障功能，跨膜电阻越小，表明肠上皮屏障损伤越严重。
2.4 细胞转染采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂，将含有靶向干扰MLCK的siRNA的质粒或空质粒转染入Caco-2细胞。MLCK的siRNA序列为:5′-CGTACGCGGAATACTTCGA-3′。
2.5 Western blot检测Caco-2细胞处理后，冰浴裂解细胞，经BCA法进行蛋白定量，后经SDS-PAGE进行电泳。电泳完毕后，将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，用相应蛋白抗体(根据抗体说明书选择合适的稀释浓度)孵育过夜，再以HRP标记的二抗室温孵育2 h后，ECL显影，以目标蛋白与内参蛋白的比值作为目的蛋白的相对表达量。
2.6 统计学处理本研究统计均在双盲条件下进行。实验数据以x±s表示，所有实验数据均采用SPSS 13.0软件处理，对照组与给药各组比较进行单因素方差分析。
3 结果 3.1 芍药苷对小肠上皮细胞Caco-2活力的影响芍药苷(5、10、20、40、80、160 μmol·L-1)孵育Caco-2细胞24 h，细胞存活率如Fig 1所示。芍药苷在40 μmol·L-1以下浓度对细胞存活率没有明显的影响，因此，本研究选择5、10、20 μmol·L-1芍药苷进行后续研究。
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| Fig 1 Effect of paeoniflorin on viability of Caco-2 cells(n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
TNF-α(5、10、20 μg·L-1)分别孵育Caco-2细胞12、24 h，检测跨膜电阻变化。如Fig 2所示，10 μg·L-1 TNF-α孵育Caco-2细胞24 h，可明显降低Caco-2细胞屏障跨膜电阻，又不至于破坏严重。因此，本研究采用10 μg·L-1 TNF-α孵育Caco-2细胞24 h模拟屏障损伤，进行后续研究。
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| Fig 2 Effect of TNF-α on transmembrane resistance(TER) of Caco-2 cell barrier function(n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
如Fig 3所示，相对于对照组，10 μg·L-1 TNF-α可明显降低Caco-2细胞屏障跨膜电阻，说明屏障通透性增加，屏障功能紊乱。5、10、20 μmol·L-1芍药苷可逆转TNF-α的作用，其跨膜电阻随着芍药苷浓度增加而逐步增加。
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| Fig 3 Effect of paeoniflorin on TNF-α induced reduction of TER in Caco-2 cells(n=6) **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs TNF-α |
如Fig 4所示，相对于正常对照组，TNF-α可明显降低紧密连接蛋白的表达，occludin和ZO-1表达均明显下降，表明TNF-α可通过降低紧密连接蛋白含量，诱发上皮细胞屏障功能紊乱。5、20 μmol·L-1芍药苷可剂量依赖性地逆转TNF-α导致的紧密连接蛋白表达下降，恢复上皮屏障功能。
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| Fig 4 Paeoniflorin reversed TNF-α induced reduction of tight junction proteins(n=6) A:Effect of paeoniflorin on TNF-α induced reduction of occludin; B:Effect of paeoniflorin on TNF-α induced reduction of ZO-1.**P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs TNF-α |
如Fig 5A所示，相对于正常对照组，10 μg·L-1 TNF-α可明显增加MLCK表达，导致黏膜屏障紧密连接功能紊乱; 5、20 μmol·L-1芍药苷呈剂量依赖性抑制TNF-α引起的MLCK高表达。如Fig 5B所示，芍药苷可以明显逆转TNF-α造成的黏膜屏障紊乱，表现为芍药苷可以抑制TNF-α导致的跨膜电阻下降，而这种逆转保护作用可被针对MLCK的siRNA明显阻断。结果表明，MLCK可能是芍药苷逆转TNF-α导致屏障功能紊乱的药物靶点。
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| Fig 5 Effects of paeoniflorin on TNF-α induced high expression of MLCK(n=6) A:Paeoniflorin inhibited TNF-α induced high expression of MLCK; B:Effects of siRNA of MLCK on paeoniflorin induced increase in TER.**P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs TNF-α |
本研究考察了芍药苷对TNF-α诱导的Caco-2细胞屏障功能紊乱的保护作用和相应机制。芍药苷在5~20 μmol·L-1的浓度范围内，可明显逆转TNF-α造成的屏障功能紊乱，包括增加跨膜电阻值、增加紧密连接蛋白表达、抑制MLCK表达。
IBD目前的病理机制尚未阐明，肠上皮屏障功能紊乱是IBD的重要发病机制[9-10]。肠上皮屏障功能紊乱会增加肠通透性，进而会诱发和加重炎性肠病[11]。肠上皮细胞能分泌多种受体，可以与细胞因子结合，参与免疫级联反应，加重炎症反应[10]。有研究表明[12]，肠上皮中包含潘氏细胞和杯状细胞等免疫细胞。潘氏细胞的缺失会增加IBD患病率，完整状态的肠上皮屏障还可以有效防止肠道病原菌的侵袭。肠上皮屏障功能紊乱会加重肠道免疫反应，破坏肠道菌群的平衡。鉴于肠上皮屏障在IBD中的重要作用，探索缓解上皮屏障功能紊乱的方法是研究治疗IBD的重要方向[11]。TNF-α是一种促炎因子[13]，可诱导结肠上皮细胞屏障功能紊乱，从而增加肠道上皮细胞通透性。因此，本研究采用TNF-α体外制备上皮细胞屏障功能紊乱模型，考察芍药苷对上皮细胞屏障功能紊乱的作用。TNF-α可促进结肠上皮细胞MLCK表达，MLCK过表达可导致紧密连接蛋白的表达下降，诱发和加重肠上皮屏障紊乱[13]。
本研究通过体外研究证实，芍药苷可以明显改善TNF-α所造成肠上皮细胞屏障功能紊乱，MLCK可能是芍药苷的潜在靶点。MLCK的siRNA可明显抑制芍药苷对肠上皮细胞屏障功能紊乱的保护作用，进一步证实MLCK是芍药苷潜在的靶点。本研究为IBD的治疗提供了一定的科学参考，但是基于MLCK在不同组织以及细胞具有广泛分布的特点，应用芍药苷抑制MLCK治疗IBD，其潜在的副作用也是以后研究的重要方向。在以后的研究中，如何增加芍药苷对不同组织细胞中MLCK的选择性，也非常重要。
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