糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种以高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病，其发病率逐年增高^[2]，并伴有多种并发症，涉及心脏、眼、肾脏、神经系统等^[1]。有关DM中枢神经病变及其与血管病变的关系，近年正逐渐引起重视。文献报道，DM患者及DM动物模型中常伴有脑血流量(cerebral blood flow，CBF)减少的现象^[2-3]。同时，有报道称临床DM患者脑血流量下降多出现在DM早期^[4-5]。那么，DM大鼠脑血流下降发生在何时，呈现什么样的变化趋势，是否与糖尿病认知障碍发生发展有关，机制如何？为此，本论文采用链脲佐菌素(streptozocin，STZ)复制DM大鼠模型，在明确DM认知障碍大鼠脑血流量变化的基础上，动态监测DM大鼠模型建立后，额叶皮层血流量的连续变化，分析变化趋势，并初步探讨其变化的机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

♂Wistar大鼠，SPF级，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。许可证号：SCXK(吉)-2011-0004，合格证号：201600012587。控制室温在(23±2)℃的范围内，相对湿度45%~55%，动物自由饮水摄食。

1.2 试剂与仪器

链脲佐菌素(美国Sigma公司)；水合氯醛(天津市光复精细化工研究所)；内皮素-1(endothelin 1，ET-1) 试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)。moorVMS双通道激光多普勒监测仪(英国Moor instruments公司)；Stoelting标准型单臂脑立体定位仪(美国Stoelting公司)；RT-6000酶标分析仪(RAYTO公司)；T6紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；血糖仪(测利得雅思血糖仪公司)。

1.3 实验动物头颅预处理

实验前1周，所有大鼠麻醉后俯卧，放置于脑立体定位仪上，固定头部，采取平颅固定法进行大鼠头颅的立体定位。之后头部剃毛，剪开头部皮肤2 cm，用过氧化氢擦拭清除软组织，暴露出颅骨。参照Paxions-Watson大鼠脑立体定位图谱(第6版)^[6]，确定额叶(FrA)位置(中心点为前囟前5 mm，矢状缝右侧旁开2 mm)，为后期正式实验做准备。

1.4 麻醉、生物节律对脑血流量变化的影响 1.4.1 麻醉时间对脑血流量变化的研究

取♂Wistar大鼠8只，体质量180~220 g，适应性喂养1周后，腹腔注射10%水合氯醛0.3 g·kg^-1麻醉，用moorVMS激光多普勒血流检测仪(LDF)进行数据收集和处理，将多普勒光纤探头固定至额叶处，记录麻醉10、20、30、40、50 min后脑血流量，并在不同时间点均连续观测10 min，通过软件分析每10 min的平均脑血流量(Flux)、红细胞浓度(Conc)、红细胞运动速度(Speed)、回光强度(DC)。

1.4.2 生物节律对大鼠脑血流量变化的影响

动物适应性喂养1周后，取♂Wistar大鼠9只，体质量180~220 g，在8 :00测定脑血流，连续测定3 d，随后在12 :00测定脑血流，连续测定3 d，最后在16 :00测定脑血流，连续测定3 d，观察日间不同时间点的Flux、Conc、Speed、DC变化。另取♂Wistar大鼠9只，分别在同一天8 :00、12 :00、16 :00 3个时间段测定Flux、Conc、Speed、DC，测定方法与“1.4.1”中步骤相同。

1.5 DM认知障碍大鼠脑额叶皮层血流量变化研究 1.5.1 动物模型建立

34只♂ Wistar大鼠，体质量180~220 g。适应性喂养1周后，随机分为对照组(n=10)、DM模型组(n=24)。禁食不禁水16 h，以冰浴的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将STZ粉末溶解，冰浴避光操作，新鲜配制1%的STZ溶液。模型组按照给药剂量60 mg·kg^-1腹腔注射，冰上避光操作，10 min内注射完毕，避免STZ溶液失效。对照组腹腔注射相同剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

1.5.2 血糖水平连续测定

STZ腹腔注射72 h后，测空腹血糖，实验前1 d更换垫料，禁食12 h，自由饮水。采用肝素化的毛细管，眼底静脉丛取血0.5 mL，3 500 r·min^-1离心10 min，分离血浆，采用葡萄糖氧化酶法测定血糖，具体操作按试剂盒说明书进行。选择空腹血糖≥16.7 mmol·L^-1动物纳入实验^[7-8]。造模后d 30、45、60、80用血糖仪测定空腹血糖(fast blood glucose，FBG)。血糖恢复的动物剔除。

1.5.3 Morris水迷宫实验

造模d 80对各组大鼠进行水迷宫实验，所有大鼠在正式实验前1 d，在不放平台及标记物的水迷宫中自由游泳2 min，以适应水中环境，避免大鼠应激反应。Morris水迷宫为直径150 cm、高50 cm的圆形水池，水池内壁被漆为黑色，水池被4个等距点分为4个象限，分别在4个象限池壁的中心贴上不同标记物，为三角形、正方形、圆形和五角星白色纸片。平台放入其中1个象限的中心，低于水面2 cm，控制水温在(23.0±2.0)℃。对大鼠进行Morris水迷宫学习训练，实验时将大鼠在除目标象限(平台所在象限)之外的3个象限随机面对池壁放入水中，记录大鼠的登台时间(逃避潜伏期，以下统称潜伏期)作为评价学习成绩的指标，潜伏期下降即学习成绩提高。大鼠在90 s内找到平台后，允许大鼠在平台上停留10 s，潜伏期为大鼠找到平台的时间；如果大鼠在90 s内未找到平台，则潜伏期记为90 s，然后将大鼠引导登上平台，允许其在平台上停留10 s，让其根据4个象限的参照物进行空间学习记忆，并减少大鼠紧张。每次训练完成后将大鼠取出擦干，以防止低体温造成的应激。

1.5.4 DM认知障碍大鼠脑额叶皮层血流量测定

在模型建立d 90，大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 g·kg^-1麻醉，用moorVMS激光多普勒血流检测仪(LDF)进行数据收集和处理，将多普勒光纤探头固定至额叶处，麻醉20 min后，连续观测10 min，通过软件分析每10 min的平均Flux，并计算Flux/100 g=Flux÷大鼠体质量×100 g。

1.6 DM大鼠脑额叶皮层血流量的动态测定 1.6.1 DM模型建立

另取34只♂Wistar大鼠，体质量180~220 g。适应性喂养1周后，随机分为对照组(n=10)、DM模型组(n=24)。造模方法见“1.5.1”。

1.6.2 血糖测定水平连续测定

测定方法与“1.5.2”操作步骤相同。分别在造模后d 3、18、32、46、60、73用血糖仪测定FBG，造模后d 11、25、39、53、67用血糖仪测定随机血糖(random blood glucose，RBG)。

1.6.3 大鼠脑额叶皮层血流量的动态测定

测定方法与“1.5.4”操作步骤相同。分别在造模d 0、7、14、21、28、35、42、56、75测定大鼠脑血流量，并计算Flux/100 g=Flux÷大鼠体质量×100 g。

1.7 大鼠脑脊液中NOS和ET-1的测定

大鼠采用10%水合氯醛0.3 g·kg^-1腹腔注射麻醉。将大鼠固定于脑立体定位仪上，保证操作台水平，两侧耳杆在同一直线，门齿杆较耳杆低0.33 cm。以食指摸后脑的三角区域，在三角区域上方插入已磨至2~3 mm的头皮针，末端连接1 mL注射器，慢慢抽取脑脊液。若未见脑脊液流出，可轻微旋转针体。采集脑脊液后，用ELISA法检测结构型一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthasec，NOS)=神经型(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)+内皮型(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)和ET-1的浓度，各项指标测定严格参照试剂盒说明书操作。

1.8 统计学分析

应用SPSS 21.0统计软件中方差分析进行数据资料处理，结果用x±s表示，当符合正态分布时，两组之间比较采用独立样本T检验，多组之间比较采用单因素方差分析检验；不符合正态分布时，组间比较则采用秩和检验。

2 结果 2.1 麻醉、生物节律对大鼠脑血流量的影响 2.1.1 麻醉后不同时间对大鼠脑血流量的影响

大鼠在麻醉后10、20、30、40、50 min分别使用多普勒血流仪检测，由Tab 1可见，Flux、Conc、Speed、DC均没有明显变化(P>0.05)，即在麻醉后10~50 min内选择任意时间开始检测脑血流均可。本研究在后续实验中，每只大鼠均在腹腔注射水合氯醛后20 min开始测脑血流量。

2.1.2 生物节律对大鼠脑血流量的影响

Tab 2~4结果显示，大鼠日间、日内Flux、Conc、Speed、DC均没有明显变化(P>0.05)。生物节律对大鼠脑血流量的测定没有影响。

2.2 DM认知障碍大鼠实验中相关指标检测结果 2.2.1 DM成模状况

本次实验以注射STZ 72 h后，空腹血糖≥16.7 mmol·L^-1为成模标准，24只模型组大鼠，成模19只，成模率为79.2%。整个实验期间死亡8只，死亡率为42.1%。

2.2.2 DM大鼠空腹血糖变化

如Fig 1所示，造模d 3、30、45、60、80，模型组大鼠的血糖明显高于对照组(P < 0.01)，一直维持高血糖状态。

2.2.3 Morris水迷宫实验结果

Tab 5水迷宫实验结果显示，DM大鼠从训练第6次开始，与对照组相比潜伏期明显延长(P < 0.01)，并持续至训练第10次。DM大鼠在行为学上出现认知障碍表现。

2.2.4 DM认知障碍大鼠脑血流量比较

DM认知障碍大鼠在造模d 90测定脑血流量变化，如Fig 2所示，与对照组相比，DM模型鼠脑血流量明显降低(P < 0.05)。

2.3 DM大鼠动态脑额叶皮层血流量的变化中相关指标结果 2.3.1 DM成模状况及代谢情况

24只模型组大鼠，成模20只，成模率为83.3%，整个实验期间死亡6只，死亡率为30%。模型组的食量、水量，在造模的d 8、15、22、29、36、43、50、57、64均明显高于对照组。模型组体质量从造模d 15开始，与对照组相比差异有显著性，且模型组体质量在50 d内一直维持恒定(Tab 6)。

2.3.2 血糖水平变化

模型组的FBG在造模的第72 h(注射STZ的d 4)、d 18、32、46、60、73均明显高于对照组(P < 0.01)；模型组的RBG在造模的d 11、25、39、53、67均明显高于对照组(P < 0.01)，见Fig 3、4。

2.3.3 DM大鼠脑额叶皮层血流量动态变化

实验期间，对照组大鼠体质量有明显变化，为避免体质量对脑血流量的影响，脑血流量各指标均采用每100 g体重值比较(Tab 7)。DM模型建立75 d内，对照组Flux/100 g没有明显变化(P>0.05)，模型组Flux/100 g在造模d 21自身比较有明显降低(P < 0.05)，并持续至d 75。

2.4 DM大鼠脑脊液中iNOS、cNOS和ET-1的变化

如Tab 8所示，DM造模d 75，与对照组相比，模型组大鼠脑脊液中iNOS和cNOS明显升高(P < 0.05)，ET-1明显下降(P < 0.01)。提示DM脑血流量的降低引发机体脑内发生自我保护反应。

3 讨论

经颅多普勒较常用于大鼠脑血流量的检测，但是在实验过程中变化因素较多，麻醉时间、生物节律等是否会对大鼠脑血流量产生影响，尚不明确。为了客观描述这些因素对实验结果的干扰，本实验首先对以上两个方面对大鼠脑血流量的影响进行研究。结果发现，麻醉后10~50 min内，各时间点之间大鼠脑血流量没有明显变化，选择其中任意一个时间点开始检测脑血流量均可，在后期实验研究中选择注射水合氯醛20 min后开始检测脑血流量。人和动物都存在有规律的循环往复的周期性运动，即“生物节律”。本研究发现，在8 :00、12 :00、16 :00大鼠脑血流量无论是日间还是日内均没有明显变化。因此，生物节律对脑血流量的变化无影响，且麻醉次数对脑血流量也没有影响，日间每天麻醉1次、连续麻醉3 d、日内1 d麻醉3次，对脑血流量均没有影响。排除生物节律对脑血流量的影响后，为了进一步防止时间顺序可能造成的影响，在实验中又采用随机数字表抽取实验动物。

本实验采用STZ 60 mg·kg^-1一次性大剂量注射复制DM大鼠模型，与对照组大鼠相比，DM大鼠在90 d内血糖升高并维持稳定，体质量下降，食量、水量均明显增多，符合DM大鼠模型特征^[9-10]。通过经典的Morris水迷宫方法对两组大鼠进行学习和记忆能力的行为学评价，发现STZ诱导的DM模型大鼠较对照组大鼠潜伏期延长，出现学习记忆能力下降的表现。

脑血流量的变化是很多脑血管疾病的病理生理基础之一。DM患者和动物中多伴有脑血流量减少的现象^[2-3]，但DM认知障碍大鼠是否也有脑血流量的异常变化，未见报道。因此，本实验首先对DM认知障碍大鼠在模型建立d 90测定脑额叶皮层血流量，发现认知障碍大鼠脑额叶皮层血流量明显降低。但DM发生认知障碍前，大鼠脑血流量的动态变化轨迹以及何时出现脑血流量减少？实验进一步研究发现，DM大鼠在造模d 21 Flux/100 g开始出现明显减少，并持续至d 75，说明DM在发生认知障碍前脑血流量就出现明显降低，提示脑血流量的减少可能是导致DM发生认知障碍的因素之一。与临床中DM患者脑血流量下降出现在DM早期的结果相符^[4-5]。脑血流指标均采用每100 g体重值比较，实验期间对照组大鼠体质量出现明显增多，为更科学地比较脑血流量变化，对照组与模型组均用Flux/100 g比较。

DM认知障碍大鼠脑血流量下降的原因尚不明确，脑缺血可以引发严重的神经损伤，影响病人的神经功能恢复和预后^[11]。iNOS、cNOS和ET-1作为血管活性物质，检测其在脑脊液中的浓度发现，与对照组相比，DM大鼠cNOS、iNOS浓度明显升高，ET-1浓度明显下降，其原因可能是脑血流量的减少引发机体本身发生自我保护作用(即自身调节功能)所致；而DM脑脊液内cNOS、iNOS浓度升高，ET-1浓度下降，也可能是DM后期脑血流量不再持续下降的原因之一。iNOS作为病理性的一氧化氮合酶，其浓度增加可能使NO生成增多，NO作为活性氧，诱发氧化应激反应，脑内出现氧化损伤，进而造成脑组织的氧化损伤，这也可能是造成认知障碍的因素之一。脑血流量下降的原因可能是：① DM患者长期高血糖引起毛细血管基底膜增厚，患者中枢神经系统和外周神经纤维出现神经元退行性病变，神经元功能减退，葡萄糖利用减少而导致脑局部供血量不足^[4-5]；② DM患者常伴随脂质代谢紊乱，造成血液黏稠度升高，血流缓慢，基底膜糖类沉积，脂肪样和透明样变性，微小血管内皮细胞功能失调，长期DM患者的脑血流自动调节受损，导致脑血流减少^[12]；③ 患有DM时，有血内韦氏因子和血小板黏附力增加，对二磷酸腺苷、肾上腺素、胶原纤维、花生四烯酸的敏感性增加，血管收缩强烈，可明显增加血流阻力，使脑缺血程度明显加重，脑缺血时间明显延长。实验室将在后续实验中进一步对其下降机制进行研究。