2. 中国人民武装警察部队后勤学院中心实验室, 天津 300162;
3. 中国人民武装警察部队后勤学院 附属医院军人医疗保健中心, 天津 300162;
4. 天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室, 天津 300309
2. Central Laboratory Logistics University of Chinese People's Armed Police Force, Tianjin 300162, China;
3. the Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People's Armed Police Force, Tianjin 300162, China;
4. Key Lab for Biomarkers of Occupational and Environmental Hazard, Tianjin 300309, China
原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常见的恶性肿瘤之一，起病隐匿，进展迅速，预后极差[1]，大多数患者在确诊时已进展到HCC晚期。索拉非尼是一种多靶点、多激酶抑制剂，是临床治疗晚期肝癌的一线用药，有效延长HCC患者的生存时间。然而，HCC患者对索拉非尼可产生耐药性，同时伴随胃肠道疾病、手足皮肤病、心血管毒性等多种并发症。这些并发症可能一定程度上影响索拉非尼的治疗效果。因此，筛选临床中索拉非尼的效应增强剂或协同效应剂成为客观需求[2]。蟾蜍灵(bufalin)以及华蟾毒配基(cinobufagin)是蟾酥发挥抗癌作用的主要活性成分，属于外源性强心苷类物质，是天然的钠钾泵(Na+/K+-ATPase)抑制因子[3]。研究表明，蟾蜍灵和华蟾毒配基通过抑制Akt信号通路诱导乳腺癌、非小细胞肺癌细胞凋亡[4-5]，通过抑制NF-κB途径诱导胰癌细胞周期阻滞和骨肉瘤细胞凋亡[6-7]。课题组前期研究发现，蟾蜍灵和华蟾毒配基作用HCC细胞可诱发细胞凋亡和细胞周期S期阻滞[8]。因此，本研究对蟾酥活性成分蟾蜍灵和华蟾毒配基联合索拉非尼在抗HCC的药理学作用机制中可能存在的协同和增效机制进行深入研究。
1 材料与方法 1.1 材料人肝癌细胞株HepG2购自协和基础医学院细胞库；蟾蜍灵、华蟾毒配基购自美国Sigma公司，无水乙醇溶解成母液，实验终浓度为1 μmol·L-1，-20℃避光保存；H-DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)、碘化丙啶(PI)、Hoechst 33342、RNaseA、Triton X-100和二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；一抗兔抗人Akt、p-Akt(Ser473)、IκB、NF-κB、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax、cyclin A、PCNA和GAPDH单克隆抗体购自美国Abcam公司；HRP标记的二抗和ECL化学发光试剂购自美国KPL公司。
1.2 细胞培养及实验分组HepG2细胞按常规方法培养。H-DMEM完全培养基中含有10%胎牛血清、1%青-链霉素、1%谷氨酰胺、1%丙酮酸钠。实验分为对照组、0.1 μmol·L-1索拉非尼组、1 μmol·L-1蟾蜍灵组、1 μmol·L-1华蟾毒配基组、1 μmol·L-1蟾蜍灵联合0.1 μmol·L-1索拉非尼组、1 μmol·L-1华蟾毒配基联合0.1 μmol·L-1索拉非尼组。
1.3 MTT检测细胞增殖活性取对数生长期HepG2细胞，以5 000个/孔的密度接种于96孔板，常规培养24 h后，按照预先设计的分组加入相应浓度的药物，分别作用12、24、48 h后，加入20 μL MTT孵育3 h后，水平离心，1 500×g离心5 min，弃上清，加入150 μL DMSO，放入温箱5 min，震荡混匀，酶标仪测定A490nm值。计算细胞生长抑制率。抑制率/% =(A对照-A实验)/(A对照-A空白)×100%。用金氏公式计算蟾酥活性成分联合索拉非尼是否有协同作用：q=E(A+B)/(EA+EB-EA·EB)。式中EA、EB分别为单独药物作用组的抑制率，E(A+B)为药物联合作用的抑制率，q>1.15为协同作用，0.85~1.15为相加作用，< 0.85为拮抗作用。实验独立重复3次。
1.4 荧光显微镜观察细胞形态实验分组同前，药物作用24 h后，离心，收集细胞，PBS洗4次，悬于200 μL PBS中，加入20 μL Hoechst 33342(终浓度为10 mg·L-1)，在37℃孵育箱中染色15 min，1 000×g离心10 min，弃上清，加入适量PBS，吹打混匀，每组细胞取3张玻片，200倍视野，在荧光显微镜下观察细胞形态。实验独立重复3次。
1.5 流式细胞术检测细胞周期常规培养细胞，待细胞融合至80%时加药，实验分组同前。24 h后胰酶消化收集细胞，PBS洗净胰酶后，细胞经预冷的75%乙醇固定过夜。上机前离心弃上清，PBS洗3次以充分洗净固定液，加入100 μL染色剂(RNaseA 100 mg·L-1、50 mg·L-1 PI、0.2% Triton X-100)，避光染色30 min后，加入400 μL预冷PBS，过300目尼龙网，流式细胞仪检测细胞周期变化。实验独立重复3次。
1.6 Western blot法检测蛋白表达常规培养细胞后加药，胰酶消化收集各组细胞，PBS洗3次，在冰上加入RIPA裂解混合液，超声细胞破碎仪破碎各组细胞，12 000×g离心10 min后留上清，BCA定量各组蛋白浓度。上样50 μg，进行半干转转膜，转移至NC膜上。5%的脱脂奶粉常温封闭1 h，一抗(1 :1 000稀释)Akt、p-Akt(Ser473)、IκB、NF-κB、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax、cyclin A、PCNA和GAPDH 4℃孵育过夜，TBST洗NC膜3次，每次15 min。二抗常温孵育1 h，TBST洗膜4次，每次10 min。将NC膜置于暗盒中，滴加ECL液化学发光(A液:B液=1 :1)，显影定影，用Scion Image软件进行灰度值分析。实验独立重复3次。
1.7 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件分析数据。计量资料以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 蟾酥活性成分与索拉非尼单独以及联合用药对HepG2细胞增殖抑制有协同作用肝癌HepG2细胞经蟾蜍灵、华蟾毒配基和索拉非尼单药处理及联合处理后，在不同时间均能出现细胞增殖抑制作用。与单独药物作用组相比，药物联合作用组对细胞的增殖抑制率明显增高(Tab 1、Fig 1)。1 μmol·L-1蟾蜍灵+0.1 μmol·L-1索拉非尼作用12、24、48 h时，q值分别为1.05、1.32、1.19。1 μmol·L-1华蟾毒配基+0.1 μmol·L-1索拉非尼作用12、24、48 h时，q值分别为1.10、1.20、1.13，在药物作用24 h时均表现为协同作用(P < 0.01)。
| Cell survival(A490nm) | Inhibition rate/% | ||||||
| 12 h | 24 h | 48 h | 12 h | 24 h | 48 h | ||
| Control | 0.347±0.009 | 0.509±0.015 | 0.740±0.010 | - | - | - | |
| Sorafenib(S) | 0.314±0.009** | 0.469±0.019** | 0.710±0.011** | 9.00 | 13.60 | 25.40 | |
| Bufalin(B) | 0.260±0.010** | 0.352±0.013** | 0.397±0.005** | 31.00 | 39.00 | 50.90 | |
| Cinobufagin(C) | 0.279±0.009** | 0.356±0.017** | 0.388±0.009** | 25.30 | 38.20 | 52.90 | |
| S+B | 0.230±0.014** | 0.246±0.025** | 0.231±0.013** | 39.60 | 62.50 | 77.60 | |
| S+C | 0.240±0.013** | 0.275±0.023** | 0.251±0.009** | 37.40 | 56.10 | 75.60 | |
| **P < 0.01 vs control group | |||||||
|
| Fig 1 Effects of bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations on proliferation of HepG2 cells (x±s, n=3) A: Effects of bufalin, sorafenib and their combination on proliferation of HepG2 cells; B: Effects of cinobufagin, sorafenib and their combination on proliferation of HepG2 cells. **P < 0.01 vs sorafenib group |
经荧光染色后(Fig 2)，荧光显微镜下可见对照组HepG2细胞核较大，被Hoechst 33342染成均匀的蓝色荧光。蟾蜍灵、华蟾毒配基和索拉非尼作用组24 h后，可见蓝染、染色质凝集的凋亡细胞形态。药物联合作用组24 h后，蓝染、染色质凝集的凋亡细胞形态大量出现。
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| Fig 2 Effects of bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations on cell morphology of HepG2 cells (× 200) A: Control group; B: Sorafenib group; C: Bufalin group; D: Cinobufagin group; E: Bufalin combined with sorafenib; F: Cinobufagin combined with sorafenib |
Fig 3流式结果显示，正常对照组细胞G0/G1、S、G2/M期比例分别为69.61%、20.85%、9.54%。索拉非尼作用24 h后，G1期细胞比例为72.88%，与对照组相比，差异有显著性(P < 0.01)，呈现G0/G1期周期阻滞。蟾蜍灵和华蟾毒配基作用24 h后，处于S期的细胞比例分别为38.17%、34.53%，与对照组的20.85%相比，差异有显著性(P < 0.01)，呈现S期周期阻滞。联合用药24 h后，索拉非尼联合蟾蜍灵以及索拉非尼联合华蟾毒配基处于S期的细胞分别上升至39.08%和38.23%，与对照组的20.85%相比，差异有显著性(P < 0.01)，呈现S期周期阻滞。
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| Fig 3 Effects of bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations on cell cycle of HepG2 cells(x±s, n=3) A: Control group; B: Sorafenib group; C: Bufalin group; D: Cinobufagin group; E: Bufalin combined with sorafenib; F: Cinobufagin combined with sorafenib; G: Changes of HepG2 cells S phases in proportion of bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combination treatment. **P < 0.01 vs control group. |
如Fig 4A所示，1 μmol·L-1蟾蜍灵、1 μmol·L-1华蟾毒配基与0.1 μmol·L-1索拉非尼单独或联合作用HepG2细胞24 h后，cyclin A、PCNA蛋白表达量下调，药物联合作用组明显下调，与正常对照组相比，差异有显著性(P < 0.01)。Cyclin A、PCNA蛋白表达量的降低，提示蟾酥活性成分与索拉非尼联合用药可能引起HepG2细胞S期细胞周期阻滞。
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| Fig 4 Effects of bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations on expression levels of relative proteins in HepG2 cells(x±s, n=3) A: The protein levels of cyclin A and PCNA in HepG2 cells treated with bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations; B: The protein levels of Bcl-2 and Bax in HepG2 cells treated with bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations; C: The protein levels of Akt/NF-κB signal in HepG2 cells treated with bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group |
如Fig 4B所示，1 μmol·L-1蟾蜍灵、1 μmol·L-1华蟾毒配基与0.1 μmol·L-1索拉非尼单独或联合作用HepG2细胞24 h后，Bcl-2蛋白表达量下调，药物联合作用组明显下调，与正常对照组相比，差异有显著性(P < 0.01)。Bax蛋白表达量上调，药物联合作用组明显上调，与正常对照组相比，差异有显著性(P < 0.01)。Bcl-2/Bax的比值下降，药物联合作用组下降明显，与正常对照组相比，差异有显著性(P < 0.01)。Bcl-2/Bax的比值常作为细胞凋亡“分子开关”，其比值的下降使细胞对凋亡抑制作用减弱，细胞出现凋亡。
2.4.3 蟾酥活性成分与索拉非尼单独以及联合用药对HepG2细胞信号通路相关蛋白表达的影响如Fig 4C所示，1 μmol·L-1蟾蜍灵、1 μmol·L-1华蟾毒配基与0.1 μmol·L-1索拉非尼单独作用或联合作用HepG2细胞24 h后，Akt、NF-κB总蛋白表达均无明显变化；p-Akt(Ser473)、p-NF-κB p65蛋白表达量下调，药物联合作用组明显下调，与正常对照组相比，差异有显著性(P < 0.01)。IκB蛋白表达量上调，药物联合作用组明显上调，与正常对照组相比，差异有显著性(P < 0.01)。
3 讨论HCC的致死率居世界第2位，其发生发展与信号通路的异常密切相关。Akt信号通路是细胞内重要信号转导通路之一。研究显示，Akt信号通路在人类肿瘤细胞中普遍失调，因此，该通路为肿瘤靶向治疗和预防转移提供新的思路。Akt抑制剂GSK2110183、MK-2206在肺癌、胰腺癌以及血液恶性肿瘤中表现出很好的治疗效果[9]。索拉非尼是一种多靶点的激酶抑制剂，经美国食品药物管理局(FDA)批准用于晚期HCC的标准治疗药物。目前已有研究发现，索拉非尼可以通过下调Akt信号途径，抑制人肝癌细胞株SMMC-7721的生长增殖[10]，但发现索拉非尼单独作用于Akt信号通路，对信号途径中的关键酶Akt、mTOR等磷酸化抑制作用却有限[11]。同时，流行病学队列研究显示，索拉非尼仅仅能延长HCC患者生存3个月，并且具有多种不良反应。因此，筛选临床中索拉非尼的效应增强剂或协同效应剂成为客观需求[2]。已有研究表明，索拉非尼联合培美曲塞通过抑制Akt途径有效诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡[12]；索拉非尼联合C2-神经酰胺通过抑制PI3K/Akt/mTOR和ERK信号通路，有效诱导肝癌细胞凋亡[13]。蟾酥及其相关制剂为我国传统的抗肿瘤药物，在我国广泛用于肝癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤的中晚期治疗，疗效明显。蟾酥注射液联合放化疗有效治疗中晚期肺癌、胃癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤[6]。相关研究报道，蟾蜍灵和华蟾毒配基通过抑制Akt信号通路，下调Bcl-2/Bax的比值，诱导结肠癌HCT116细胞和非小细胞肺癌细胞凋亡[6]。
本研究将蟾蜍灵、华蟾毒配基分别与索拉非尼联合作用于肝癌HepG2细胞，结果显示，蟾蜍灵、华蟾毒配基和索拉非尼对肝癌HepG2细胞均有抑制增殖的作用，且呈时间依赖性。药物联合作用时抑制增殖作用更加明显，并在作用24 h后产生协同抑制效果。同时出现了染色质凝集等细胞凋亡形态，药物联合作用细胞凋亡形态更为明显。流式结果显示，索拉非尼将细胞阻滞在G1期，蟾蜍灵和华蟾毒配基单药以及与索拉非尼联合作用使细胞阻滞在S期。Cyclin A是正向细胞周期调控蛋白，在G1晚期出现合成，S期开始检测到激酶活性，促进DNA的复制合成。PCNA是真核细胞DNA合成所必须的一种核蛋白，是DNA聚合酶的辅助蛋白，直接参与DNA的复制[8]，G1期后期开始出现，S期达到高峰，G2/M期明显下降。本研究中发现，药物联合后cyclin A、PCNA的蛋白表达下降更为明显，从而推断药物联合以后可能引起S期细胞周期阻滞，抑制肿瘤细胞的增殖。
Akt信号通路是细胞内重要信号转导通路之一，PI3K激活的Akt可以通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、caspase-9、NF-κB等，是重要的抗凋亡调节因子[14]。NF-κB是介导细胞内信号传递最重要的核转录因子，在多数细胞中，NF-κB以同源二聚体或异源三聚体的形式与其抑制蛋白IκB直接结合，形成三聚体复合物，以无活性形式存在于多种类型细胞内。当细胞受到刺激时，有信号诱导激活IκB激酶(IKK)，引起IκB的降解，使NF-κB快速入核，与DNA接触，从而调控下游基因的表达。通过诱导抗凋亡因子Bcl-2蛋白家族，启动凋亡抑制因子(X-chromosome linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)，促进癌基因c-Myc的激活，进而对凋亡信息产生抗性，与肿瘤的发生发展息息相关。相关研究报道，NF-κB的持续活化可作为包括乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等实体瘤和白血病的标志[15]。提示我们，阻断NF-κB的活化，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡为恶性肿瘤的治疗提供了新的思路。Bcl-2家族蛋白在线粒体内源性凋亡通路中起着重要作用，Bcl-2具有拮抗细胞凋亡作用，Bax具有促进细胞凋亡的作用，Bcl-2与Bax的比值对药物诱导的细胞凋亡起着决定性的作用[16]。本研究发现，药物作用肝癌HepG2细胞后，单独药物作用组与药物联合作用组Akt、NF-κB总蛋白表达水平没有明显变化，但是，p-Akt(Ser473)、p-NF-κB p65蛋白表达明显降低，且药物联合作用组降低程度更加明显；Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低，药物联合作用组降低程度更加明显；IκB、Bax蛋白表达水平逐渐升高，药物联合作用组升高更为明显。结果显示，蟾蜍灵、华蟾毒配基联合索拉非尼抑制Akt信号通路，直接或间接抑制IKK活性，减少IκB蛋白的降解，从而抑制NF-κB通路，减少Bcl-2蛋白表达水平，促进Bax的表达，使Bcl-2/Bax的比值下降，从而抑制细胞增殖和诱导凋亡。
综上，蟾酥活性成分蟾蜍灵和华蟾毒配基协调索拉非尼通过下调Akt/NF-κB信号通路，抑制肝癌HepG2细胞增殖。
( 致谢: 本文实验在天津武警后勤学院中心实验室完成，衷心感谢课题组老师和同学的协助 )
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