2. 山西医科大学，山西 太原 030001
2. School of Public Health, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
糖尿病可以引起心血管系统发生相应的结构和功能改变，其中对冠状动脉(coronary artery, CA)的损伤会引起糖尿病冠心病(coronary heart disease, CHD)。有研究报道，糖尿病病人患CHD的风险会比其他疾病明显增加[1]，而且高血糖能够损伤CA血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)电压依赖性钾通道(voltage-gated K+ channels, Kv)[2]。在VSMC上主要表达的钾通道中，Kv是表达量最高的[3-4]，而且最新研究发现，Kv1.5对调节CA供血是必需的[5]。
槲皮素(quercetin, quer)作用广泛，可对抗氧化反应[6-7]、抑制炎症[8]等。研究发现，如果在膳食中摄入比较多的槲皮素，能够大幅度降低心血管疾病的风险[9]。而且我们课题组前期离体实验发现，槲皮素可舒张大鼠CA，与其增大Kv电流有关[10]。有研究报道，饮食中较多摄入黄酮可降低糖尿病及相关心血管疾病发生风险[11-12]，然而，关于槲皮素是否会对糖尿病引起的大鼠CA损伤产生影响，尚未见相关研究。
综上所述，糖尿病能够通过抑制CA VSMC Kv引起CA损伤，而槲皮素舒张大鼠CA与增大CA VSMC Kv电流有关，并且Kv1.5对调节CA供血至关重要。所以，我们提出实验假设，槲皮素是否能够通过增大Kv1.5，改善糖尿病大鼠CA损伤。因此在本课题中，我们综合应用离体心脏灌流、CA张力测定、膜片钳电生理和PCR实验，从Kv1.5角度研究槲皮素在保护糖尿病引起大鼠CA损伤中的作用。
1 材料 1.1 药品与试剂槲皮素购自Sigma公司，美国；其余试剂为分析纯，国产。
1.2 实验动物30只SD大鼠，♂，7~8周龄，体质量(220±20) g，购自山西医科大学动物中心。
1.3 仪器血管张力测定仪：澳大利亚DMT公司；膜片钳放大器：美国AXON公司；离体心脏灌流装置：泰盟科技有限公司；PCR仪：美国Bio-Rad C1000 TM and CFX96TM Real-time system。
2 方法 2.1 糖尿病大鼠模型的制备与分组将大鼠(30只)随机分组，空白对照组(10只)：生理盐水，i.p.；糖尿病组(20只)：链脲佐菌素，i.p.，每日100 mg·kg-1，连续2 d给药。2周后，如果血糖>0.0167 mol·L-1，认为糖尿病模型制备成功，成功造模20只。然后，将这部分大鼠继续分组：糖尿病组(10只，生理盐水，i.g.，8周)和槲皮素干预组(10只，每日槲皮素50 mg·kg-1，i.g.，连续8周)。
2.2 离体心脏灌流大鼠麻醉后处死，开胸并快速将大鼠心脏连同主动脉根部剪下，利用主动脉根部将心脏固定于灌流装置上，记录每分钟的CA流量(coronary flow，CF)。
2.3 CA张力测定参照本课题组前期方法[10, 13]，把大鼠CA固定到张力测定仪上，正式实验前需要验证血管的活性，用KCl(60 mmol·L-1)收缩CA，当收缩幅度能达到3 mN以上，且坪台能够稳定时，可以继续实验。分别向浴槽内加入不同的药物：KCl(60 mmol·L-1)、Kv阻断剂4-氨基吡啶(4-aminopyridine, 4-AP, 10-4 mol·L-1)、KCa阻断剂蝎毒素(iberiotoxin, Iber, 10-3 mol·L-1)、KATP阻断剂格列本脲(glibenclamide, Glib, 10-4 mol·L-1)和KIR阻断剂氯化钡(barium chloride, BaCl2, 10-3 mol·L-1)，观察CA的收缩反应并记录其张力数值。
2.4 Kv电流记录方法采用分开两步进行酶解的方法得到CA VSMC，对细胞进行序列电压刺激(-80 mV~ +60 mV，间隔为10 mV)，或单一给予+60 mV刺激)，记录Kv电流。不论是序列电压刺激还是单一电压刺激，均选择最后50 ms的电流值，并且取其平均值，CA VSMC分离方法及Kv记录方法参照文献[10]。
2.5 RT-PCR检测大鼠CA Kv1.5 mRNA表达大鼠处死后，显微镜下急性分离3组大鼠CA，并快速将CA放入液氮中保存，观察3组大鼠CA Kv1.5 mRNA变化，内参为β-actin，具体方法参照文献[14]。Kv1.5引物，正向: 5′-ATGCAGGGTCACTCCATC-3′，反向：5′-GGCTTCTCCTCTTCCTTG-3′；β-actin引物，正向：5′-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3′，反向：5′-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3′。
2.6 统计学方法所有数据用x±s表示，Graphpad prism6作图，应用两因素重复测量方差分析。
3 结果 3.1 槲皮素对糖尿病大鼠CF的影响正常对照组CF为(7.81±0.62) mL·min-1，糖尿病组CF明显下降，其值为(6.13±0.45) mL·min-1，给糖尿病大鼠膳食补充槲皮素8周后，其CF有所增加，其值为(7.14±0.52) mL·min-1，见Tab 1。
| Group | CF/ mL·min-1 |
| Control | 7.81±0.62 |
| Diabetes | 6.13±0.45* |
| Diabetes+quer | 7.14±0.52*# |
| *P＜0.05 vs control; #P＜0.05 vs diabetes | |
KCl对空白组大鼠CA的最大收缩张力为(3.64±0.27) mN；糖尿病组大鼠的收缩幅度明显增强，达到(5.12±0.44) mN；膳食补充槲皮素可减弱糖尿病大鼠CA对KCl的收缩反应，其收缩幅度为(4.35±0.16) mN。与糖尿病组相比，“糖尿病+槲皮素”组CA对Kv通道阻断剂4-AP的收缩幅度明显低于单纯糖尿病组，证实槲皮素减轻糖尿病所致CA损伤的作用与激活Kv有关，见Tab 2。
| Vasoconstrictor | KCl | 4-AP | Iber | BaCl2 | Glib |
| Control | 3.64±0.27 | 3.01±0.45 | 3.17±0.36 | 3.78±0.42 | 3.46±0.52 |
| Diabetes | 5.12±0.44* | 4.21±0.51* | 4.37±0.27* | 4.64±0.39* | 4.76±0.47* |
| Diabetes+quer | 4.35± 0.16*# | 3.24±0.40# | 4.16±0.27* | 4.30±0.32* | 4.36±0.17* |
| *P＜0.05 vs control; #P＜0.0.5 vs diabetes | |||||
如Fig 1所示，空白对照组、糖尿病组、“糖尿病+槲皮素”组大鼠CA VSMC Kv最大电流密度分别为(54.52±4.15) pA·pF-1、(22.62±3.24) pA·pF-1和(41.40±2.45) pA·pF-1。与空白组相比，糖尿病组CA VSMC Kv电流明显减小，差异有统计学意义；糖尿病组补充槲皮素后，其CA VSMC Kv电流降低幅度有所减弱。
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| Fig 1 The Kv currents on isolated rat CA VSMC (n=6) A: The I-V relationship curve of Kv currents when the currents were evoked by a series of depolarizing pulses (from -80 mV to +60 mV); B: The Kv currents were recorded when the currents were evoked by +60 mV depolarizing pulses. *P < 0.05 vs control; #P < 0.0.5 vs diabetes. |
如Fig 2所示，Kv1.5 mRNA在3组大鼠CA的相对表达量(与β-actin表达的比值)依次为：空白对照组表达量最多，“糖尿病+槲皮素”组次之，糖尿病组表达量最少。
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| Fig 2 The mRNA expression of Kv 1.5 on rat CA (n=6) A: The photograph of electrophoresis of RT-PCR amplification of Kv1.5 mRNA on rat CA; B: The mRNA expression of Kv1.5 normalized to the amount of β-actin. 1: β-actin of control, 2: Kv1.5 of control, 3: β-actin of diabetes+quer, 4: Kv1.5 of diabetes+quer, 5:β-actin of diabetes, 6: Kv1.5 of diabetes.*P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs diabetes. |
CA给心肌细胞提供养分，其管壁主要是VSMC。在本实验中我们发现，糖尿病组的CF明显低于正常组，在糖尿病大鼠的饮食中补充8周槲皮素后，其CF有所回升，说明糖尿病削弱了大鼠CA的舒张能力。而且该结论在离体CA张力测定中也得到了进一步证实，糖尿病组大鼠CA对KCl的收缩反应更敏感，而补充槲皮素后得到了好转。此外我们发现，糖尿病补充槲皮素组CA对Kv通道阻断剂4-AP的收缩反应明显低于糖尿病组，而对其他几种阻断剂没有明显差异，这提示槲皮素减轻糖尿病所致CA损伤与激活Kv有关。
课题组前期研究发现，槲皮素可舒张正常SD大鼠CA，该作用与激活大鼠CA VSMC Kv有关[10]。因此，为了进一步证实槲皮素对糖尿病所引起CA损伤的改善作用是否也与Kv相关，我们记录了3组大鼠CA VSMC Kv电流，其最大电流密度分别为：空白对照组(54.52±4.15) pA·pF-1，糖尿病组(22.62±3.24) pA·pF-1，糖尿病+槲皮素组(41.40±2.45) pA·pF-1。有研究报道，高浓度葡萄糖可损伤CA VSMC Kv[2]，在本实验中我们也发现了与之相一致的现象，糖尿病组Kv电流较空白对照组明显降低，膳食补充槲皮素可以得到改善。
在目前已经明确的钾离子通道中，VSMC上表达最多的是Kv，Kv在调节CA张力方面起着关键性的作用[15]，而且最新研究发现Kv1.5对调节CA供血是必需的[5]。在本实验中，我们进一步通过RT-PCR实验测定CA VSMC Kv1.5 mRNA表达变化，得出了与前述实验相吻合的结论，同时也证明槲皮素是通过激活Kv1.5起到了对糖尿病所导致的大鼠CA损伤的保护作用。本课题的实验结果将为临床使用槲皮素预防和治疗糖尿病CA损伤提供基础依据。
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