心血管疾病是全球性的重大公共卫生问题，在我国心血管疾病一直处于上升趋势，超过30%的心血管疾病患者死因是缺血性心脏病，严重影响人类健康^[1]。及时恢复血流是减少心肌缺血损伤的最有效方法，然而心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)时引起氧自由基生成增加、炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡等，导致心肌组织永久性或致死性的损伤^[2]。研究显示^[3]，再灌注前给予一些预处理能够明显降低心肌I/R损伤。远距缺血后处理(remote ischemic postconditioning，RIPostC)是在缺血心肌再灌注前，对远离心脏的组织器官给予短暂的I/R干预，可减轻较长时间的再灌注损伤^[4]。因此，RIPostC的心肌保护作用及其相关机制值得我们深入研究。

近年研究发现，Rho激酶信号通路参与了心肌I/R损伤等心血管疾病，Rho激酶通过介导下游肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)的磷酸化，引起冠状动脉痉挛加重心肌损伤^[5]。给予Rho激酶阻断剂法舒地尔(fasudil，Fas)可能通过诱导自噬的发生，减少心肌梗死面积，降低心肌细胞凋亡，减轻I/R损伤^[6-7]。那么，远距缺血后处理的心肌保护作用是否也与抑制Rho激酶有关，尚未见报道。本研究通过复制在体大鼠远距缺血后处理模型，观察在激动或阻断Rho激酶作用下对远距缺血后处理心肌保护作用的影响，探讨Rho激酶信号通路在远距缺血后处理中的作用及其相应的作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

30只SPF级SD大鼠，♂，体质量(300±50) g，由蚌埠医学院实验动物中心提供，实验动物许可证编号：SCXK(沪)2013-0006。

1.1.2 药品与试剂

盐酸法舒地尔，天津红日药业股份有限公司；溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)，美国Sigma公司；肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脱氢酶(actate dehydrogenase，LDH)试剂盒，南京建成生物工程研究所；鼠抗磷酸化肌球蛋白轻链(phospho-myosin light chain，p-MLC)、兔抗GAPDH，美国Cell Signaling Technology公司；羊抗小鼠、羊抗兔抗体，武汉博士德生物工程有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、QuickBlock^TM Western封闭液，上海碧云天生物技术研究所；ECL发光液，美国Millipore公司。

1.1.3 仪器

动物呼吸机，ALC-V9型，上海奥尔科特生物科技有限公司；生物信号采集处理系统，MedLab-U/4C501H，南京美易科技有限公司；酶标仪，BioTek-Epoch，美国伯腾仪器有限公司；电泳仪，Bio-Rad，美国伯乐公司；冷冻高速离心机，Eppendor-5810R，德国艾本德股份公司。

1.2 方法 1.2.1 模型制备

4%水合氯醛(10 mL·kg^-1)腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉完全后，将大鼠仰卧位固定于手术台上，连接MedLab生物信号采集处理系统，记录Ⅱ导联心电图，进行气管插管连接呼吸机，呼吸频率为70~80 times·min^-1，潮气量为20~30 mL·kg^-1。分离右侧颈总动脉，与压力换能器相连，记录全程动脉血压。大鼠开胸暴露心脏后，用无创伤缝合线在肺动脉圆锥与左心耳之间的LAD中上1/3处的心肌表层下方穿过，用聚四氟乙烯管穿过线的两端，拉紧线造成缺血，心电图ST段抬高表示缺血成功。缺血45 min后松开线，冠状动脉再灌注180 min，完成心肌I/R损伤模型。

1.2.2 实验分组

30只♂SD大鼠随机分成5组：① 假手术组(Sham)：开胸，冠状动脉左前降支(left anterior descending，LAD)穿线不结扎，持续225 min。② 缺血/再灌注组(I/R)：LAD缺血45 min，再灌注180 min。③ 远距缺血后处理组(RIPostC)，参考本实验室前期研究的模型制备方法^[8-9]，手术操作同I/R组，在LAD缺血15 min后，结扎大鼠一侧股动脉使其缺血5 min+再灌注5 min，给予3次循环。④ 缺血/再灌注+Fas组(I/R+Fas)，同I/R组，并于再灌注前5 min静脉注射Rho激酶阻断剂Fas(10 mg·kg^-1)。⑤ 远距缺血后处理+LPA组(RIPostC+LPA)：同RIPostC组，但在再灌注前5 min静脉注射Rho激酶激动剂LPA(每只1mg)^[10]。

1.2.3 血流动力学指标和心电图观测指标测定

MedLab生物信号采集处理系统在大鼠颈总动脉插管后全程记录平均动脉压(mean arterial blood pressure，MAP)和心率(heart rate，HR)的变化。Ⅱ导联心电图全程监测，并计算各实验组在Baseline、缺血45 min、复灌30、60、120、180 min时心电图ST段抬高幅度。

1.2.4 血浆CK、LDH的活性变化水平

于再灌注180 min，用一次性肝素钠采血管取腹主静脉血，以3 000 r·min^-1离心15 min，留取上清液置于-80℃冻存备用。严格按照CK试剂盒和LDH试剂盒说明书，分别在波长660 nm和440 nm，光径1 cm，测定各管吸光度值，根据公式得出血浆CK和LDH活性。

1.2.5 HE染色病理组织形态学观察

实验结束后留取左室前壁心肌组织，用生理盐水冲去血污，在心脏结扎线以下留取100 mg心脏组织(切成4 mm厚的心肌片)，放入4%的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜观察。

1.2.6 心肌梗死面积测定

再灌注180 min后立即取出心脏，用PBS冲洗2~3次后结扎冠脉，将1% Evans blue从主动脉处注入心脏，于-80℃冷冻后，沿着左心室横切面切成2 mm厚的均匀薄片，放置在1%氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazoliume chloride，TTC)溶液中，37℃恒温避光染色20 min，4%的多聚甲醛溶液中固定30 min。灰白色区域为梗死区(percentage infarct size，IS)，砖红色区域为危险区(area at risk，AAR)。采用Image J图像分析软件，计算心肌梗死面积/%=IS/AAR×100%^[11]。

1.2.7 Western blot检测p-MLC蛋白表达水平

实验结束后，留取大鼠缺血区域心肌组织100 mg，加入1 mL含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，冰上研磨，离心后取上清液，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。取上样量40 μg，SDS-PAGE凝胶电泳分离。电泳条件：浓缩胶恒压60 V，约30 min；分离胶恒压90 V，约90 min。转膜：恒流200 mA，约2 h。QuickBlock^TM封闭液室温封闭2 h，小鼠抗大鼠多克隆抗体(p-MLC 1 :2 000)、兔抗大鼠多克隆抗体(GAPDH 1 :3 000)37℃孵育30 min，60 r·min^-1摇床30 min，4℃过夜；羊抗小鼠IgG(1 :4 000)、羊抗兔IgG(1:8 000)37℃孵育20 min，100 r·min^-1室温摇床40 min；TBST洗膜4次，前3次每次10 min，最后1次5 min；ECL显影，用Image J软件对目的条带进行灰度值分析，结果以目的条带和内参的比值表示。

1.2.8 统计学方法

采用SPSS16.0软件对各组数据进行处理和分析，组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)，实验数据以x±s表示。

2 结果 2.1 血流动力学指标

5组大鼠MAP、HR基础值差异均无统计学意义。与Sham组相比，其余各组在缺血期和再灌注期MAP、HR均降低，除复灌180 min外，其余各时间段差异均有统计学意义(P＜0.05)。与I/R组相比，RIPostC组MAP升高，且再灌注30、60 min时差异具有统计学意义(P＜0.05)，IR+Fas组MAP升高，且再灌注30、60、120 min差异具有统计学意义(P＜0.05)。与RIPostC组相比，RIPostC+LPA组MAP、HR在缺血45 min时明显降低，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。见Fig 1。

2.2 心电图ST段变化

与Sham组相比，其余各组大鼠在缺血45 min及复灌30、60、120 min、I/R组180 min时心电图ST段抬高幅度明显增加，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。与I/R相比，RIPostC组、I/R+Fas组心电图ST段幅度降低，且在缺血45 min、复灌30、60、120 min时差异具有统计学意义(P＜0.05)。与RIPostC相比，RIPostC+LPA组ST段幅度增加，且在缺血45 min、复灌30、60、120 min时差异具有统计学意义(P＜0.05)。见Fig 2。

2.3 血浆CK和LDH

的变化与Sham组相比，I/R组、RIPostC+LPA组CK、LDH活性升高，且差异具有统计学意义(P＜0.05)；与I/R组相比，RIPostC组、I/R+Fas组CK、LDH活性明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与RIPostC组相比，RIPostC+LPA组CK、LDH活性明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见Fig 3、4。

2.4 心脏组织形态学变化

HE染色显示(Fig 5)，Sham组大鼠心肌纤维排列规则，结构清晰，炎性细胞浸润较少，细胞形态学表现基本正常；IR组心肌纤维断裂，排列不规则，大量心肌细胞变性、水肿、炎性细胞浸润。与I/R组相比，RIPostC和I/R+Fas组心肌纤维排列基本规则，炎性细胞浸润也明显减轻。与RIPostC组相比，RIPostC+LPA组心肌纤维明显增粗，排列紊乱、部分心肌细胞水肿。

2.5 心肌梗死面积变化

与I/R组相比，RIPostC与I/R+Fas组心肌梗死面积明显减小(P＜0.05)，与RIPostC组相比，RIPostC+LPA组心肌梗死面积明显增加(P＜0.05)。结果显示，RIPostC和使用Rho激酶抑制剂能明显降低大鼠I/R后的心肌梗死面积，而使用Rho激酶激动剂则心肌梗死面积增加。见Fig 6。

2.6 大鼠心肌组织p-MLC蛋白表达

与Sham组相比，I/R组、RIPostC+LPA组p-MLC活性明显增加(P＜0.05)；与I/R组相比，RIPostC组、I/R+Fas组p-MLC活性明显降低(P＜0.05)；与RIPostC组相比，RIPostC+LPA组p-MLC活性明显增加(P＜0.05)。见Fig 7。

3 讨论

Rho激酶是分子质量为160 ku的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与变异性心绞痛、心力衰竭、心肌I/R损伤等疾病的发生^[12]。大量研究表明^[13]，Rho激酶在I/R损伤中扮演重要角色，抑制Rho激酶能够改善缺血心肌的能量代谢，抑制炎症反应和细胞凋亡等作用。激活Rho激酶，可通过抑制肌球蛋白活性，引起胞质内MLC磷酸化，增加平滑肌细胞Ca²⁺的敏感性，导致平滑肌收缩冠状动脉痉挛，加重心肌损害^{[5, 12]}。本实验结果显示，与Sham组相比，I/R组p-MLC表达明显增高，说明I/R损伤明显增强Rho激酶的活性。与I/R组比较，使用Rho激酶抑制剂Fas后，p-MLC表达水平明显降低。在RIPostC组中，我们也同样观察到p-MLC表达水平明显降低，说明远距缺血后处理具有类似法舒地尔的作用，抑制Rho激酶活性；而与RIPostC相比，在RIPostC组中使用Rho激酶激动剂LPA后，p-MLC的表达量明显增高，Rho激酶的活性增强，进一步提示远距缺血后处理的心肌保护作用与Rho激酶的信号通路有关。

心肌I/R损伤时，可引起氧自由基生成增加、钙超载、炎症反应、线粒体损伤、膜通透性增加，心肌酶大量漏出，细胞凋亡等，使冠状动脉功能障碍，加重心肌细胞损伤^{[4, 11]}。CK和LDH是目前较常用的心肌酶检测指标，CK、LDH的少量漏出提示细胞膜的通透性增高，漏出情况反映出细胞膜的受损程度。此外，CK、LDH从心肌组织到血液的漏出也是急性心肌梗死的标志，临床上早期血液中CK、LDH升高，可作为诊断急性心肌梗死的标准之一^{[7, 14]}。实验结果显示，与Sham组相比，I/R组血浆中CK、LDH活性明显增加，心肌损伤加重。与I/R组相比，RIPostC组、I/R+Fas组CK、LDH活性明显降低，心肌损伤有所改善，提示远距缺血后处理和使用Rho激酶的抑制剂法舒地尔都能够减轻I/R导致的心肌细胞损伤。而与RIPostC组相比，RIPostC+LPA组CK、LDH活性明显增加，说明Rho激酶活性增强，可降低远距缺血后处理的心肌保护作用。

本实验同时还观察各组大鼠血流动力学指标、心肌组织HE染色及梗死面积的改变。结果显示，与I/R相比，RIPostC组、I/R+Fas组血流动力学MAP、HR增高和心电图ST段降低，心肌组织病理形态有明显改善，心肌纤维排列较整齐，炎性细胞浸润减轻，心肌梗死面积减少。而给予Rho激酶激动剂LPA减弱了RIPostC的保护作用，进一步说明远距缺血后处理的保护作用可能与降低Rho激酶的活性有关。

综上所述，Rho激酶信号通路可能参与了远距缺血后处理抗大鼠心肌I/R损伤的作用，远距缺血后处理通过抑制Rho激酶的活性减轻心肌细胞的损伤，发挥抗心肌I/R损伤作用。当然，Rho激酶在远距缺血后处理的确切机制，仍有待于我们进一步深入研究，以期为其今后应用于临床提供重要的理论依据。

( 致谢: 本实验在蚌埠医学院科研中心心脑血管实验室完成，在此特别感谢参与本实验的所有老师和同学。)