2. 甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000
2. College of Pharmacy, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou Gansu 730000
肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)本是一种常见的肝脏自我修复过程，但在长期炎症或肝损伤等诱因下，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)被持续激活并转化为肌成纤维细胞，同时活化的HSC大量增殖并分泌过量的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，致使ECM合成与降解平衡失调，导致ECM大量沉积，最终导致肝组织正常结构与功能被破坏，即形成HF[1]。研究表明[2]，HF的进程始终都伴有炎症反应，各种炎症因子与信号通路之间相互作用，形成级联放大效应，不断加重肝损伤和HF。Janus激酶2/信号转导和转录激活子3(janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3, JAK2/STAT3) 信号通路是一条由细胞因子刺激的信号转导通路，主要参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等生物学过程。在HF研究中发现，JAK2/STAT3信号通路激活后，可上调肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等炎症因子表达，并进一步活化HSC，加速HF的发展进程[3]。因此，JAK2/STAT3通路及相关炎症因子是不断加重HF的主要因素之一，通过抑制JAK2/STAT3通路信号转导，可作为缓解HF的重要途径。
HF是肝脏炎症发展为肝硬化或肝癌的必经之路，抑制HF进展是防止慢性肝病发展为不可逆肝硬化或肝癌的有效手段，但HF发病机制复杂，涉及众多细胞因子或信号通路，且存在交互作用，目前临床尚无公认的有效抑制HF的药物[4]。
本研究阳性药物秋水仙碱能够通过抗炎等途径抑制HF[5]，但存在肾毒、骨髓抑制等潜在的严重副作用[6]，限制了其临床应用。中药治疗具有多层次、多靶点和多通路的特点，并且副作用小，对于防治慢性疾病有着独特的优势[7]，例如，中药三七总皂苷可通过抑制JAK2/STAT3通路及其它多种途径缓解HF[8]。杠板归为蓼科蓼属植物杠板归(Polygonum perfoliatum L.)的干燥地上部分，具有清热解毒、利水消肿、止咳的功效，主治咽喉肿痛、肺热咳嗽、湿热泻痢等[9]。本课题组前期研究表明，杠板归总黄酮(total flavonoids extracted from Polygonum perfoliatum L，TFP)可通过抑制炎症反应缓解小鼠肝损伤，并且能够缓解二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine, DMN)诱导的HF，但具体机制未明确[10-11]。本实验在明确TFP抗HF的药效基础上，通过观察TFP对JAK2/STAT3通路及相关炎症因子的影响，揭示TFP抗HF作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物清洁级8~10周龄♂SD大鼠，体质量200 g~300 g，购于桂林医学院实验动物中心。
1.2 杠板归总黄酮的制备[11]取2 kg杠板归生药粉碎，过80目筛，体积分数为0.75的乙醇回流提取2次，料液比1 :10(g :mL)，每次1.5 h，合并提取液，过滤，减压蒸馏，浓缩得杠板归总黄酮浸膏，加蒸馏水混匀后，盐酸调pH值为5。D101型大孔吸附树脂进行纯化，上样流速为4 mL·min-1，然后静置12 h，先后用3倍树脂体积的体积分数为0.3的乙醇和4倍体积的体积分数为0.7的乙醇洗脱，流速3 mL·min-1，将体积分数为0.7的乙醇洗脱液收集并浓缩至浸膏(纯度83.52%)。
1.3 试剂D101型大孔吸附树脂(河北翔泰蓝星精细化工有限公司)；二甲基亚硝胺(DMN，天津市化学试剂研究所，纯度99%)；秋水仙碱粉剂(美国Sigma公司)。谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malonaldehyde，MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；透明质酸(hyaluronic acid，HA)、层黏连蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前胶原(procollage type Ⅲ，PCⅢ)、Ⅳ型胶原(collage type Ⅳ，Ⅳ-C)、TNF-α、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6) 试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(南通市碧云天生物技术研究所)；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3抗体(美国CST公司)；PVDF膜(美国Bio-Rad公司)；抗β-actin单抗(天锡傲锐东源生物科技有限公司)；辣根酶标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Super ECL Plus超敏发光液(北京普利莱基因科技有限公司)。
1.4 动物分组与处理90只大鼠适应性喂养1周后，随机分为6组，即正常组、模型组、秋水仙碱(0.1 mg·kg-1)组和TFP(200、100、50 mg·kg-1)组，每组15只。实验期间，大鼠自由饮食，温度18~22℃，自然光照。除正常组外，其余各组大鼠均腹腔注射体积分数为0.5%的DMN生理盐水溶液(2 mL·kg-1)，隔天注射1次，连续8周。从造模d 1起，灌胃体积按照体质量计算(10 mL·kg-1)，药物配制成相应浓度，各给药组分别给予相应剂量的药物进行干预，正常组和模型组给予等体积的溶媒，每天1次。8周后实验结束，末次给药后，禁食不禁水12 h，腹腔注射质量浓度为3 g·L-1戊巴比妥钠生理盐水溶液(10 mL·kg-1)麻醉，腹主动脉取血，4 500 r·min-1离心15 min后，取上层血清，-20 ℃保存；固定位置取肝组织，于-80 ℃保存。
1.5 病理学指标检测固定位置取肝组织，经中性甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片(厚4 μm)、脱蜡、苏木精-伊红(HE)染色等常规制作HE染色切片，光学显微镜下观察肝组织病理学变化。
1.6 血清学指标检测按照试剂盒说明，测定血清中ALT、AST、SOD、MDA、HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量。
1.7 炎症因子检测取相同位置肝组织，制备10%肝组织匀浆，ELISA检测TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。
1.8 检测肝组织中HF相关蛋白表达情况每组随机选取5只大鼠肝组织，固定位置取肝组织60 mg，放入玻璃匀浆器中，加入含1% PMSF的RIPA组织裂解液1 mL，于冰上充分匀浆，然后4℃，15 000 r·min-1离心15 min，取上清液，BCA试剂盒测定蛋白含量。加入蛋白上样缓冲液，95℃水浴变性5 min。配制10%分离胶，5%浓缩胶，样品上样，进行SDS-PAGE电泳，分离蛋白(5%浓缩胶电压80 V，10%分离胶电压110 V)；恒流150 mA条件下转膜3 h，将分离蛋白转移至PVDF膜；将PVDF膜放入5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，加入一抗，4℃孵育过夜；TBST洗涤3次，每次10 min，然后放入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，再用TBST洗涤3次，每次10 min，增强化学发光法显色，胶片曝光，显影，定影，胶片扫描后使用Quantity One 4.6软件分析蛋白灰度，以β-actin为内参，计算目标蛋白相对表达量。
1.9 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行数据分析，结果以x±s表示，采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 TFP对DMN诱导的HF大鼠肝组织病理学影响正常组大鼠肝小叶结构完整，无炎症细胞浸润，未见纤维结缔组织等病理变化。模型组肝小叶结构严重紊乱，假小叶形成，大量肝细胞坏死，较多炎症细胞浸润，汇管区出现纤维结缔组织增生。与模型组比较，秋水仙碱组和TFP组大鼠肝细胞坏死得到显著缓解，肝小叶结构基本完整，炎性浸润较轻，假小叶和纤维结缔组织增生明显减少(Fig 1)。
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| Fig 1 Effect of TFP on hepatic histopathology in HF rats(HE, ×200) A: Normal group; B: Model group; C: Colchicine 0.1 mg·kg-1 group; D: TFP 200 mg·kg-1 group; E: TFP 100 mg·kg-1 group; F: TFP 50 mg·kg-1 group |
与正常组比较，模型组血清中ALT、AST和MDA含量或活性明显升高(P＜0.01)，SOD活性明显降低(P＜0.01)；经TFP干预后，与模型组比较，ALT、AST和MDA含量或活性明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，SOD活性明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，见Tab 1。
| Group | Dose/mg·kg-1 | ALT/IU·L-1 | AST/IU·L-1 | SOD/kU·L-1 | MDA/μmol·L-1 |
| Normal | - | 20.2±5.6 | 25.6±6.1 | 270.6±25.4 | 2.93±0.29 |
| Model | - | 394.5±48.6## | 506.3±57.3## | 171.5±16.9## | 5.56±0.51## |
| Colchicine | 0.1 | 280.8±30.4** | 365.6±35.6** | 210.3±18.5** | 4.72±0.39** |
| TFP | 200 | 250.4±27.6** | 323.0±31.2** | 211.3±17.7** | 4.56±0.38** |
| 100 | 267.9±26.5** | 340.6±32.9** | 209.4±17.0* | 4.75±0.40* | |
| 50 | 298.0±28.9* | 380.7±36.2* | 189.6±17.8 | 5.22±0.52 | |
| ##P＜0.01 vs normal; *P＜0.05, **P＜0.01 vs model | |||||
与正常组相比，模型组血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量明显上升(P＜0.01)；与模型组比较，TFP能降低HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量(P＜0.05或P＜0.01)，见Tab 2。
| Group | Dose/mg·kg-1 | HA/μg·L-1 | LN/μg·L-1 | PC Ⅲ/μg·L-1 | Ⅳ-C/μg·L-1 |
| Normal | - | 100.5±18.4 | 50.1±10.2 | 50.6±9.8 | 40.2±7.6 |
| Model | - | 325.6±60.1## | 153.4±31.2## | 200.5±44.8## | 121.3±30.8## |
| Colchicine | 0.1 | 210.8±41.8** | 80.5±15.3** | 115.7.3 ±20.8** | 79.6±15.3** |
| TFP | 200 | 185.2±33.6** | 85.7±17.8** | 117.5.3±17.6** | 80.4±17.9** |
| 100 | 210.7±39.5** | 98.6±19.9* | 126.3±21.3** | 87.6±18.5* | |
| 50 | 231.0±43.8** | 105.7±20.1* | 140.2±23.8* | 95.4±20.3 | |
| ##P＜0.01 vs normal; *P＜0.05, **P＜0.01 vs model | |||||
与正常组相比，模型组大鼠肝组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显上升(P＜0.01)；与模型组比较，TFP可明显降低TNF-α、IL-1β和IL-6表达(P＜0.05或P＜0.01)，见Tab 3。
| Group | Dose/mg·kg-1 | TNF-α/ng·g-1 | IL-1β/ng·g-1 | IL-6/ng·g-1 |
| Normal | - | 140.8±18.2 | 180.5±39.6 | 91.2±8.4 |
| Model | - | 641.5±58.8## | 910.5±190.5## | 300.2±23.5## |
| Colchicine | 0.1 | 470.5±40.6** | 510.2±100.1** | 180.7±14.4** |
| TFP | 200 | 450.2±38.5** | 490.5±89.3** | 169.3±13.3** |
| 100 | 480.9±40.3** | 536.8±109.6** | 181.2±15.0** | |
| 50 | 510.6±42.6* | 580.5±111.2* | 221.2±17.3* | |
| ##P＜0.01 vs normal; *P＜0.05, **P＜0.01 vs model | ||||
Fig 2结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1、p-JAK2和p-STAT3表达明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，TFP可明显抑制α-SMA、TGF-β1、p-JAK2和p-STAT3表达(P＜0.05或P＜0.01)。
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| Fig 2 Effect of TFP on relative protein expression in liver tissues of HF rats(x±s, n =5) A: Expression of HF-related protein in liver tissues by Western blot; B: Relative expression levels of HF-related protein in liver tissues; C: The ratio of phosphorylated protein/total protein. 1: Normal group; 2: Model group; 3: Colchicine 0.1 mg·kg-1 group; 4: TFP 200 mg·kg-1 group; 5: TFP 100 mg·kg-1 group; 6: TFP 50 mg·kg-1 group.##P < 0.01 vs normal group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model group |
本实验采用的大鼠腹腔注射DMN诱导HF模型，具有成模时间短、重复性好和持续时间长等特点，因此成为研究抗肝纤维化药物的首选模型[12]。当肝脏受到损伤时，肝细胞膜通透性增加，肝细胞内的ALT和AST溢出进入血液，因此血清中ALT和AST的活性与肝损伤程度呈一致性[13]。研究表明[14]，当肝脏发生纤维化病变时，HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量与HF程度同步提高，可作为评价HF病变程度的指标。在本研究中，模型组大鼠血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量明显升高，且肝组织病理检查也显示出现大量纤维结缔组织增生，表明DMN诱导大鼠HF模型建立成功。TFP可明显降低大鼠ALT、AST、HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C水平，并改善肝组织病变。以上研究表明，TFP能够抗DMN诱导的大鼠HF，具有明显的保肝作用。
氧自由基和过氧化物作为危害机体健康的物质，可严重破坏细胞结构，造成组织损伤，MDA是体内主要脂质过氧化物产物，与氧化应激水平密切相关；SOD是重要的抗氧化酶，能够有效清除自由基，抑制脂质过氧化物的产生，对机体产生防御作用[15]。TFP能够提高SOD活性，降低MDA含量，表明TFP可能通过增强肝脏抗氧化能力，从而发挥保肝作用。
TGF-β1贯穿HF过程的始终，能够持续激活HSC，不断刺激HSC分泌ECM，加重HF病情，是目前所知最强的致HF细胞因子[16]。α-SMA作为HSC的活化标志物，能够反映HSC活化水平。研究表明，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子与JAK2/STAT3信号通路有着密切的关系[17]，磷酸化的JAK2和STAT3介导信号转导，在诱导多种炎症因子大量表达的同时，炎症因子可通过正反馈激活JAK2/STAT3通路，从而不断产生大量炎症因子，持续活化HSC，导致肝组织不断损伤，加重HF病情[18]。因此，抑制JAK2/STAT3通路激活可作为缓解HF的有效途径。实验结果表明，模型组大鼠肝组织α-SMA水平明显升高，TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、p-JAK2和p-STAT3表达明显上升，JAK2/STAT3通路被激活。TFP干预可明显下调α-SMA、TGF-β1、TGF-β1、TNF-α和IL-1β表达，并抑制JAK2/STAT3通路激活，改善肝组织病变。
在HF中，氧化应激、TGF-β1和JAK2/STAT3通路异常表达呈现一致性[19-20]，但三者之间是否存在直接调控关系，尚未见报道。本实验结果显示，杠板归总黄酮可有效改善DMN诱导的大鼠HF，其机制可能与抗氧化、抑制TGF-β1表达和JAK2/STAT3通路及相关炎症因子有关，其之间的相互作用关系，可作为本研究下一步深入探索的方向。
( 致谢: 本实验是在桂林医学院药物研究所完成，感谢王刚、陈雪梅、葸博婷等同学提供的帮助！)
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