糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的并发症之一，主要的病理特征为肾纤维化，其中占据整个肾脏体积90%的肾间质纤维化是决定DN进展的关键因素[1]。肾小管上皮细胞-间质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是导致肾间质纤维化的重要机制之一。在各种致纤维化因子的作用下，肾小管上皮细胞逐渐失去上皮细胞表型，并获得间质细胞表型，导致肾小管基底膜破坏，并分泌大量细胞外基质，最终引起肾间质纤维化[2]。由此可见，肾小管EMT在DN肾纤维化的发生发展过程中起着关键作用。因此，深入探讨肾间质纤维化的机制，对于探寻延缓DN病理进程的药物作用靶点，开发DN的防治药物具有非常重要的意义。
DN的发病机制非常复杂，高血糖被认为是DN形成过程中的主要始动因子。在高血糖的长期刺激下，细胞内多种信号分子激活，最终导致靶器官的损害。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是生长因子受体超家族信号转导通路中的重要激酶。PI3K激活后可以促进下游蛋白激酶B(Akt)的磷酸化激活，活化的Akt与PI3K一同促进下游靶蛋白的磷酸化，参与调控细胞增殖和生长，与恶性肿瘤、糖尿病、类风湿关节炎等多种疾病的发生、发展密切相关[3-4]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K/Akt通路下游的重要效应蛋白[5]。在多种慢性肾脏疾病中，mTOR的激活可促使肾脏出现细胞外基质积聚及肾间质纤维化，促进蛋白尿的形成。雷帕霉素作为mTOR的特异性抑制剂，无论对1型还是2型糖尿病动物模型，均可减轻早期DN的肾脏或肾小球的肥大，阻止系膜细胞的延伸、迁移，改善肾脏纤维化[6-7]。然而，由于其具有较强的免疫抑制作用，大大限制了雷帕霉素作为防治DN药物的临床应用。因此，从阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路的角度，开发抑制肾间质纤维化的DN防治药物将成为可能性较强的新思路。
近年来的研究发现，黄酮类化合物能促进细胞分化，诱导细胞程序性死亡，抑制血管发生和调节转录活性。黄酮在发挥药理作用的机制之一正是通过抑制细胞信号转导过程中的酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶C、PI3K的活性实现的。本课题组长期从事糖尿病并发症的药物防治研究，结果证实以黄酮类为主要成分的银杏叶提取物能够通过抑制氧化应激以及PI3K/Akt/mTOR信号通路，改善肾小球肥大、细胞外基质的积聚，以及肾间质的纤维化，对糖尿病引起的肾损害具有较好的保护作用[8-9]。那么，同样以黄酮类为主的桑叶总黄酮是否对DN也具有同样的药理作用，目前国内外尚未见报道。因此，本研究通过一次性腹腔注射链脲佐菌素法建立在体1型糖尿病小鼠模型，观察桑叶总黄酮对小鼠的血糖、肾功能、肾脏病理变化的影响，并对PI3K/Akt/mTOR信号通路中的关键蛋白进行测定，阐明桑叶总黄酮对肾间质纤维化的防治作用及机制，为进一步研发有效的糖尿病防治药物提供实验依据。
1.1 材料与仪器 1.1.1 实验动物健康♂KM小鼠，体质量18 ~ 22 g，由徐州医科大学实验动物中心提供，许可证编号：SCXK(沪)2013-0016。实验期间小鼠自由进食、进水。
1.1.2 药物与试剂桑叶总黄酮(上海博蕴生物有限公司，批号：ZL150306)，链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美国Sigma公司，货号：S0130)，葡萄糖试剂盒(上海荣盛生物科技有限公司，货号：361500)，肌酐试剂盒(南京建成生物研究所，货号：C011-2)，尿素氮试剂盒(南京建成生物研究所，货号：C013-2)，尿微量白蛋白试剂盒(上海古朵生物科技有限公司，货号：GD-VN9853)，Masson三色染色试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，货号：16071)，天狼星红染色试剂盒(上海博古生物科技有限公司，货号：C035-2)。抗体Laminin(货号：ab11575)、Collagen Ⅳ(货号：ab6586)、α-SMA(货号：ab32575) 和PI3K(货号：ab86714) 均购于英国Abcam公司，抗体p-mTOR(Ser2448)(货号：5536)、mTOR(货号：2983)、E-cadherin(货号：3195) 购于美国CST公司，抗体β-actin(货号：AP0060)、Akt(货号：BS1810) 和phospho-Akt(Ser473)(货号：BS4007) 购于Bioworld公司。
1.1.3 仪器高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司，5804R)，电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司，AL104)，酶标仪(美国BioTek公司，Elx808)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司，Ⅸ53)，双色红外激光成像系统(美国LI-COR公司，odyssey Sa 700，800双通道)，SDS-PAGE电泳装置、电转移装置及分析系统为Bio-Rad产品。
1.2 方法 1.2.1 模型建立采用单次大剂量150 mg·kg-1腹腔注射STZ建立1型糖尿病小鼠模型，同时设立正常对照组(N)，STZ注射3 d后进行空腹血糖监测，将空腹血糖水平＞13.9 mmol·L-1作为模型建立成功的依据。
1.2.2 动物分组将1型糖尿病模型成功小鼠随机分为4组：模型组灌胃给予溶剂对照(DM)；灌胃给予桑叶总黄酮0.25 g·kg-1剂量组(ML)；灌胃给予桑叶总黄酮0.5 g·kg-1剂量组(MM)；灌胃给予桑叶总黄酮1 g·kg-1剂量组(MH)；N组灌胃给予溶剂对照。每日给药1次，连续灌胃给药12周后，处理动物进行取材。
1.2.3 血清肌酐、尿素氮、尿微量白蛋白的测定在给药12周后，随机收集尿液，利用ELISA方法测定尿微量白蛋白的含量。摘眼球取血，3 000×g离心15 min，分离血清后测定血清肌酐、尿素氮。
1.2.4 肾脏形态学和免疫组织化学观察取小鼠肾脏常规脱水，石蜡包埋，切片4 μm，进行Masson、Sirus red染色和Ⅳ型胶原、层黏连蛋白的免疫组织化学染色观察。
1.2.5 Western blot法检测肾皮质组织中相关蛋白表达称取50~100 mg肾皮质组织，加入0.5~1 mL RIPA组织裂解液(1 mmol·L-1 PMSF、1 mmol·L-1 Na3VO4、20 mmol·L-1 NaF)，用组织匀浆机在冰浴中匀浆，并在冰上裂解30 min。吸出并置于冰上裂解30 min。将组织匀浆液于4℃、12 000×g离心15 min。吸出上清，并用BCA蛋白测定试剂盒测定样本中蛋白浓度。等量的样品经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转膜、3%封闭液封闭1~2 h，分别进行一抗孵育4℃过夜，二抗室温避光孵育1 h，清洗后拍照。蛋白表达水平用Image J软件进行灰度分析，以β-actin为内参。
1.3 数据统计与分析数据采用SPSS 13.0统计软件处理，数据以x±s表示，数据符合方差齐性的采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多组间比较采用LSD检验；若数据不符合方差齐性，则采用Dunnett′s T3检验。
2 结果 2.1 小鼠一般情况小鼠造模后，出现多饮、多食、多尿及体质量减轻。在实验期间，模型组和高剂量组，各有2只小鼠死亡；低剂量和中剂量组，各有3只小鼠死亡，系死于糖尿病，与灌胃、桑叶总黄酮无关。
2.2 桑叶总黄酮对小鼠血糖、体质量的影响由Tab 1可知，DM小鼠的空腹血糖明显高于正常小鼠(P＜0.01)，而DM小鼠的体质量明显低于正常小鼠(P＜0.01)。给予桑叶总黄酮低、中、高剂量12周后，与模型组相比，3个剂量桑叶总黄酮的空腹血糖均有所下降(P＜0.05或P＜0.01)，而对体质量无明显影响(P＞0.05)。
| Group | FBG/mmol·L-1 | Body weight/g | ||
| Pre-treatment | 12 w post treatment | Pre-treatment | 12 w post treatment | |
| N(n=8) | 6.31±0.92 | 7.19±1.20 | 24.64±3.17 | 40.46±6.94 |
| DM(n=8) | 29.50±3.50** | 34.83±4.03** | 25.07±4.44 | 28.86±5.18** |
| ML(n=7) | 29.99±2.11** | 29.69±2.65**# | 23.47±4.31 | 28.46±1.89** |
| MM(n=7) | 30.87±1.30** | 27.31±5.51**## | 22.64±2.24 | 26.23±3.81** |
| MH(n=8) | 29.85±2.70** | 23.20±4.31**## | 22.81±2.45 | 30.17±4.11** |
| **P＜0.01 vs N; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs DM | ||||
肾重指数(kidney index)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和尿微量白蛋白(mAlb)是反映肾功能的重要指标。Tab 2结果显示，糖尿病小鼠用桑叶总黄酮治疗12周后，与正常组小鼠相比，模型组小鼠在饲养12周后肾指数、Cr、BUN以及mAlb总量均明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，中、高剂量桑叶总黄酮可以明显降低糖尿病小鼠肾指数(P＜0.01)，且3个剂量桑叶总黄酮均可降低糖尿病小鼠Cr、BUN以及mAlb水平(P＜0.01)，从而发挥改善肾功能的作用。
| Group | Kidney index/mg·g-1 | Cr/μmol·L-1 | BUN/mmol·L-1 | mAlb/μg·L-1 |
| N(n=8) | 13.64±0.76 | 12.97±8.43 | 3.03±0.93 | 284.70±28.56 |
| DM(n=8) | 18.72±1.58** | 59.70±9.24** | 12.87±2.45** | 673.93±116.6** |
| ML(n=7) | 18.55±1.62** | 22.13±7.11## | 6.98±2.15**## | 442.33±69.13**## |
| MM(n=7) | 15.11±1.96## | 25.67±27.43## | 4.70±2.09## | 354.19±59.26## |
| MH(n=8) | 16.06±2.75*## | 20.75±7.74## | 4.90±1.12*## | 423.95±155.80## |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs N; ##P＜0.01 vs DM | ||||
为了观察桑叶总黄酮对糖尿病小鼠肾纤维化的影响，我们使用肾脏切片的Masson染色、天狼星红染色以及Ⅳ型胶原免疫组化染色，评估小鼠的肾纤维化水平。如Fig 1A、1B显示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠肾脏切片中肾小球及肾间质区域Masson和天狼星红染色阳性区域面积明显增多(P＜0.01)，表明糖尿病小鼠肾脏中胶原蛋白沉积增多。给予桑叶总黄酮后可以不同程度地减少胶原蛋白的沉积(P＜0.05或P＜0.01)。对肾脏切片中的Ⅳ型胶原免疫组织化学研究结果(Fig 2A)显示，糖尿病小鼠肾皮质中Ⅳ型胶原表达增多(P＜0.01)，低、中、高剂量的桑叶总黄酮可以降低糖尿病小鼠肾皮质中Ⅳ型胶原的表达(P＜0.01)，从而减轻了小鼠肾纤维化的程度。
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| Fig 1 Effects of total flavonoid from Mori folium on degree of collagen deposition in renal cortex of diabetic mice A:Masson staining and statistical analysis of renal cortex sections of diabetic mice(×400); B: Sirus red staining and statistical analysis of renal cortex sections of diabetic mice(x±s, n=3).**P < 0.01 vs N; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs DM |
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| Fig 2 Effects of total flavonoid from Mori folium on degree of renal fibrosis in diabetic mice A: Type Ⅳ collagen expression and statistical analysis of renal cortex of diabetic mice through immunohistochemistry(×400); B: Laminin expression and statistical analysis of renal cortex of diabetic mice(x±s, n=3).**P < 0.01 vs N; ##P < 0.01 vs DM |
层黏连蛋白(laminin)是细胞外基质的重要组成成分。我们运用免疫组织化学方法来评估糖尿病小鼠肾皮质中细胞外基质的水平。与正常组相比，在糖尿病小鼠肾皮质中，尤其是在肾小管基底膜以及肾小管间质区域，层黏连蛋白表达增多(P＜0.01, Fig 2B)。各浓度的桑叶总黄酮治疗组的小鼠都表现出层黏连蛋白沉积的减少(P＜0.01)。以上结果表明桑叶总黄酮可以改善糖尿病所致的小鼠间质纤维化。
2.5 桑叶总黄酮对糖尿病小鼠肾皮质中E-cadherin以及α-SMA蛋白表达的影响肾小管上皮细胞转分化是肾间质纤维化的早期过程，为了进一步证实桑叶总黄酮对肾间质纤维化的作用，我们检测了肾皮质中EMT标志蛋白的表达情况。与正常组小鼠相比，模型组小鼠肾皮质中上皮细胞表型蛋白E-cadherin表达减少(P＜0.05)，中、高剂量的桑叶总黄酮可以有效逆转此变化(P＜0.05, Fig 3A)。模型组小鼠间质细胞表型蛋白α-SMA与正常对照组相比，表达明显增多(P＜0.01)，低、中、高剂量组桑叶总黄酮均可逆转此变化(P＜0.05或P＜0.01，Fig 3B)。以上结果表明，桑叶总黄酮可以改善糖尿病状态下肾小管上皮细胞向间质细胞的转变，从而延缓肾间质纤维化的进程。
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| Fig 3 Effect of total flavonoid from Mori folium on expression of E-cadherin and α-SMA in renal cortex of diabetic mice(x±s, n=6) A:Expression of E-cadherin in the renal cortex of diabetic mice by Western blot; B: Expression of α-SMA in the renal cortex of diabetic mice.*P < 0.05, **P < 0.01 vs N; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs DM |
为了探讨桑叶总黄酮改善肾间质纤维化的分子机制，我们观察了糖尿病状态下PI3K/Akt/mTOR信号通路的变化，以及桑叶总黄酮对该信号通路中PI3K的蛋白表达及Akt和mTOR的磷酸化水平的影响。与正常组小鼠相比，糖尿病小鼠肾皮质中PI3K的蛋白表达、Akt及mTOR的磷酸化水平均明显增高(P＜0.01)，表明糖尿病状态下小鼠肾皮质中PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活。给予桑叶总黄酮干预后我们发现，中、高剂量的桑叶总黄酮可以明显降低糖尿病小鼠肾皮质中PI3K的蛋白表达(P＜0.05)；同时低、中、高3个剂量的桑叶总黄酮均可以降低糖尿病小鼠肾皮质中Akt及mTOR的高磷酸率(P＜0.05或P＜0.01)(Fig 4A~4C)。以上结果表明，中、高剂量桑叶总黄酮可以抑制糖尿病状态下小鼠肾皮质中PI3K/Akt/mTOR的激活。
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| Fig 4 Effect of total flavonoid from Mori folium on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway(x±s, n=6) A:Expression of PI3K in the renal cortex of diabetic mice by Western blot; B: Expression of p-Akt and Akt in the renal cortex of diabetic mice; C: Expression of p-mTOR and mTOR in the renal cortex of diabetic mice.**P < 0.01 vs N; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs DM |
桑科植物(Morus alba L.)的药材——桑叶是一种干燥叶，其有效成分主要为总生物碱、总黄酮及多糖类等，其中桑叶的茎叶中黄酮类化合物含量较高[10]。韩国和日本学者已经从桑叶中分离出9种类黄酮，包括芸香苷、槲皮素、异槲皮苷、槲皮素-3-三葡糖苷等化合物，具有降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等广泛的药理作用[11-12]。由于其许多药理作用皆与DN发病环节相关，我们对其进行了初步的研究。在本实验中，糖尿病小鼠经每日给药1次，连续灌胃低、中、高剂量[13]桑叶总黄酮12周后，中、高剂量组可有效降低糖尿病小鼠血糖、肾重指数、血清肌酐、尿素氮以及尿微量白蛋白，提示其对糖尿病引起的肾功能损害具有一定的保护作用。
胶原蛋白和层黏连蛋白是细胞外基质的重要组成成分。为了观察糖尿病小鼠肾纤维化的严重程度，我们采用Masson染色、Sirus red染色和免疫组织化学的方法检测了糖尿病小鼠肾皮质中胶原的生成情况。糖尿病小鼠饲养12周后，肾小球及肾小管间质区域胶原蛋白，尤其是Ⅳ型胶原蛋白的沉积增多，并且存在层黏连蛋白的表达增多。桑叶总黄酮的治疗不仅对糖尿病小鼠血糖、肾重指数、肾功能有所改善，而且还可以减少肾小球及肾小管间质的胶原纤维的蓄积，降低层黏连蛋白的表达，减缓肾纤维化的进程。
考虑到肾小管EMT是导致肾纤维化的重要机制之一，我们推测，在糖尿病肾病小鼠中，桑叶总黄酮可能通过抑制EMT过程，从而改善肾功能，并延缓肾纤维化的发生与发展。对此，我们对小鼠肾皮质中的EMT标志蛋白进行了检测。结果显示，DN小鼠肾皮质中上皮细胞的标志蛋白E-cadherin表达降低，而间质细胞的标志蛋白α-SMA表达增多。给予桑叶总黄酮治疗后，可以逆转糖尿病小鼠肾皮质中E-cadherin表达下调以及α-SMA的沉积。由此我们认为，中、高剂量的桑叶总黄酮可以有效地保护或延缓糖尿病状态下肾小管EMT过程。
Cho等[14]研究发现，PI3K/Akt信号通路的激活是诱导EMT的关键环节，进而促进了纤维化的发展。我们前期研究也表明，在大鼠肾小球系膜细胞与db/db小鼠中，PI3K抑制剂LY-294002能抑制高糖诱导的Akt磷酸化和EMT的发生，说明PI3K/Akt通路的激活促进了EMT的发生，在糖尿病肾病的病理进程中发挥重要作用[15]。mTOR是Akt通路下游的一种进化上高度保守的细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是控制细胞增殖、生长的细胞内信号转导系统的中心环节，可调节细胞生长、增殖和代谢，广泛参与DN发生发展的不同环节。并且我们以往的研究也证实，在糖尿病大鼠中Akt/mTOR信号通路被激活，进一步发展形成EMT[9]。本实验中，DM组小鼠肾皮质中PI3K蛋白表达、Akt及mTOR磷酸化水平明显增加，表明PI3K/Akt/mTOR信号参与了糖尿病状态下肾间质纤维化的发生。给予桑叶总黄酮后，PI3K蛋白表达及Akt、mTOR磷酸化水平均明显下降，表明中、高剂量桑叶总黄酮可能是通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路改善了肾间质纤维化。
综合以上实验研究可见，中、高剂量的桑叶总黄酮能够降低血糖，改善糖尿病大鼠肾脏功能，减少肾脏组织中胶原的沉积形态，具有较好的肾脏保护作用。这种作用可能是桑叶总黄酮通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活，进而阻抑肾小管EMT过程而起效的，从而改善了糖尿病肾间质纤维化。如能充分应用和发挥桑叶总黄酮的药理作用，将为我国开发新的防治DN的天然药物提供理论和实践基础，推动中药现代化的发展。
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