2. 重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆 400016
2. Chongqing Key Labrotory of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Chongqing 400016, China
结肠癌是一种常见的恶性消化系统肿瘤，具有较高的死亡率，仅次于肺癌和肝癌[1]。结肠癌的发病原因与多种因素有关。近年来，随着对结肠癌发病原因的深入研究，其临床治疗效果有了较大的提高，尤其是靶向治疗药物的应用, 但结肠癌的治疗效果及预后总体上仍不理想[2]。治疗结肠癌目前所面临的主要挑战包括传统化疗药物的严重毒性反应、癌细胞转移和耐药。因此，临床仍急需开发新型有效的药物，以提高结肠癌的治疗效果。传统中药及其来源的有效单体成份是抗肿瘤药物的重要来源之一，如喜树碱及其衍生物等早已用于临床治疗结肠癌[3]。汉防己甲素(即汉防己碱，tetrandrine，Tet)来源于防己科植物粉防己(汉防己，Stephaniatetrandra S. Moore)的干燥根，属于二苄基异喹啉类生物碱。Tet是一种钙通道阻滞剂，临床可用于治疗高血压、关节炎、神经及肌肉痛等[4]。近年研究表明，Tet还具有抗肿瘤作用，能抑制多种肿瘤细胞增殖并促进其凋亡，如肝癌、乳腺癌、结肠癌等，但介导这种作用的具体分子生物学机制目前尚不十分清楚[5-6]。本研究发现，Tet能抑制结肠癌细胞增殖和促进凋亡，这种作用可能与其上调TGF-β1表达进而抑制PI3K/Akt信号有关，但具体分子机制尚需进一步分析。本研究结果有利于促进将Tet作为抗肿瘤药物或辅助抗肿瘤药物用于治疗结肠癌，提高结肠癌的治疗效果。
1 材料与方法 1.1 试剂及细胞培养HCT116细胞购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。汉防已甲素购自西安昊轩生物科技有限公司; 实验所用抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；TGF-β1抑制剂(LY364947) 购于赛力克公司(Selleck)。HCT116细胞的培养条件为：DMEM培养基(高糖，含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素以及0.1 g·L-1链霉素)，5% CO2及37 ℃。
1.2 实验设计及分组将HCT116细胞按实验设计分为对照组和实验组。Tet用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，实验组细胞按实验设计，用不同浓度Tet进行处理；对照组细胞采用体积相同的DMSO进行处理。
1.3 重组腺病毒载体构建本实验所用重组腺病毒采用AdEasy系统构建[7]。用PCR扩增目的基因编码序列并克隆到穿梭质粒，或将人工合成的干扰RNA片段连接到穿梭质粒。将测序正确的穿梭质粒线性化后，与BJ5183-AdEasy细菌进行重组，然后将重组的质粒线性化并转染到HEK-293细胞包装病毒，得到目的基因或干扰RNA的重组腺病毒。即GFP重组腺病毒(AdGFP)、TGF-β1重组腺病毒(Ad TGF-β1) 和PTEN干扰RNA重组腺病毒(AdsiPTEN)，其中AdGFP作为空白对照。
1.4 细胞增殖能力检测采用CCK-8试剂盒(#C008-3，七海生物)检测细胞增殖能力。将生长良好的HCT116细胞接种到96孔板中，细胞密度为3×103/孔。细胞壁贴后用不同浓度Tet或相同体积的DMSO处理，分别于24、48、72 h进行检测。每孔加10 μL CCK-8试剂并孵育4 h，然后用酶标仪测定吸光度，测定波长为450 nm。每组实验重复3次。
1.5 细胞周期分析将HCT116均匀种于6孔板，待细胞贴壁后按预试结果，用不同浓度Tet(1、2、4 μmol·L-1)或相同体积DMSO处理细胞。48 h后收集细胞，用PBS(4 ℃)重悬并离心(800 r·min-1×5 min，2次)。用预冷的70%、50%以及30%乙醇进行固定，并用PBS(4 ℃)洗涤。加入1 mL PI(20 g·L)溶液(含RNA酶，1 g·L-1)孵育30 min。最后通过流式细胞仪进行周期分析。每组实验重复3次。
1.6 Annexin V-EGFP检测凋亡将生长良好的HCT116均匀种于24孔板，细胞贴壁后，按实验设计用不同浓度Tet(1、2、4 μmol·L-1)或相同体积DMSO处理细胞。24 h后将细胞清洗2次，然后每孔加入500 μL缓冲液和2 μL Annexin V-EGFP融合蛋白，室温下孵育5 min，然后丢弃缓冲液，并用PBS(4 ℃)清洗细胞2次。最后利用荧光显微镜摄像。每组实验重复3次。
1.7 RNA提取及real-time PCR实验将细胞种于T25培养瓶中，贴壁后，按实验设计加入相应的处理因素。采用异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取总RNA，通过逆转录反应(reverse transcription, RT)制备cDNA，然后通过real-time PCR检测目的基因表达情况。实验所用PCR引物如下：GAPDH上游引物5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3′, 下游引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′；TGF-β1上游引物5′-CCCACAACGAAATCTATGACAA-3′, 下游引物5′-AAGATAACCACTCTGGCGAGTC-3′；PCNA上游引物5′-GGCTCTAGCCTGACAAATGC-3′, 下游引物5′-GCCTCCAACACCTTCTTGAG-3′。每组实验重复3次。
1.8 Western blot实验将生长良好的HCT116细胞种于6孔板，按实验设计，将细胞用不同浓度Tet(1、2、4 μmol·L-1)或相同体积DMSO处理。于相应时间点提取总蛋白，采用BCA法测定样品总蛋白浓度。然后按常规Western blot实验方法进行实验，最后利用化学发光试剂(ECL)显影并采集图像。每组实验重复3次。
1.9 免疫荧光实验将细胞均匀种于24孔板中，贴壁后，按实验设计用不同重组腺病毒处理细胞。48 h后，将细胞用4%甲醛固定，PBS清洗后，用0.3%的Triton X-100处理10 min。PBS清洗后用山羊血清封闭20 min，然后用一抗(p-Akt1/2/3) 孵育过夜(4 ℃)。PBS清洗后，再孵二抗(FITC标记)。用PBS清洗后加DAPI(100 μg·L-1)孵育10 min。PBS清洗后封片，荧光显微镜下采集图像。每组实验重复3次。
1.10 统计学分析采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，实验数据以x±s表示。利用SNK检验法进行组间比较。
2 结果 2.1 Tet对HCT116细胞增殖的影响CCK-8测试结果显示，Tet呈浓度和时间依赖性抑制HCT116细胞增殖(Fig 1A)。定量PCR分析结果显示，Tet明显呈浓度依赖性抑制PCNA表达(Fig 1B)。细胞周期分析结果显示，Tet明显增加G1期细胞比例而降低S期细胞比例，表明Tet能诱导细胞发生G1期阻滞(Fig 1C)。结果提示，Tet对HCT116细胞增殖具有明显抑制作用。
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| Fig 1 Effects of Tet on proliferation of HCT116 cells A:CCK-8 assay results showed the effect of Tet on proliferation of HCT116 cells; B:Real-time PCR analysis result showed the effect of Tet on the mRNA level of PCNA in HCT116 cells; C:Flow cytometery analysis results showed the effect of Tet on cell cycle in HCT116 cells. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control. |
诱导肿瘤细胞凋亡是大多数抗肿瘤药物的一个重要特点。本研究就Tet影响HCT116细胞凋亡的情况进行分析。Annexin V-EGFP染色结果显示，Tet在2 μmol·L-1时已能明显诱导细胞凋亡(Fig 2A)。Western blot分析结果显示，Tet明显呈浓度依赖性增加HCT116细胞中Bad的蛋白水平，下调Bcl-2的蛋白水平(Fig 2B)。结果提示, Tet能促进HCT116细胞凋亡。
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| Fig 2 Effects of Tet on apoptosis in HCT116 cells A:Annexin V-EGFP staining results showed the effect of Tet on apoptosis in HCT116 cells; B:Western blot assay results showed the effect of Tet on the protein level of Bad and Bcl-2 in HCT116 cells |
TGF-β对细胞增殖与分化具有重要调节作用。文献报道[8]，TGF-β1与结肠癌关系密切。Tet能明显抑制HCT116细胞增殖和促进凋亡，但这种作用是否与TGF-β1有关，尚不清楚。定量PCR分析结果显示，Tet在HCT116细胞中能明显促进TGF-β1的mRNA表达(Fig 3A)。Western blot分析结果显示，Tet能明显增加HCT116细胞中TGF-β1的蛋白水平(Fig 3B)，并且TGF-β1在几种结肠癌细胞中的表达水平明显高于FHC细胞(Fig 3C)。结果提示, Tet在结肠癌细胞中能促进TGF-β1表达，并且可能与Tet抗结肠癌作用有关。
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| Fig 3 Effects of Tet on expression of TGF-β1 in HCT116 cells A:Real-time PCR analysis results showed the effect of Tet on the mRNA expression of TGF-β1 in HCT116 cells. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; B:Western blot analysis results showed the effect of Tet on the protein level of TGF-β1 in HCT116 cells; C:Western blot analysis results showed the endogenous protein level of TGF-β1 in FHC and the commerical available colon cancer cell lines. |
为明确TGF-β1对Tet抑制HCT116细胞增殖和促进其凋亡作用的影响，本研究利重组腺病毒介导的TGF-β1外源性表达和TGF-β1抑制剂进行相应的实验。结果显示，外源性过表达TGF-β1抑制HCT116细胞增殖，并增强Tet对HCT116细胞的增殖抑制作用；TGF-β1抑制剂对HCT116细胞增殖无明显影响，但可明显减弱Tet对HCT116细胞增殖的抑制作用(Fig 4A)。Western blot分析结果显示，外源性高表达的TGF-β1虽对Tet诱导Bad蛋白水平增加的作用无明显影响，但能明显降低Bcl-2的蛋白水平(Fig 4B)；抑制TGF-β1能减弱Tet对Bad表达的促进作用，并部分逆转Tet对Bcl-2表达的抑制作用(Fig 4C)。结果提示，Tet抑制HCT116细胞增殖和促进细胞凋亡可能部分通过其促进TGF-β1表达介导，但TGF-β1抑制HCT116细胞增殖的机制尚不清楚。
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| Fig 4 Effects of TGF-β1 on anti-proliferation potential of Tet in HCT116 cells A:CCK-8 assay results showed the effect of TGF-β1 on Tet-induced proliferation inhibition in HCT116 cells. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Tet; B:Western blot analysis results show the effect of TGF-β1 on the protein levels of Bad and Bcl-2 affected by Tet in HCT116 cells; C:Western blot analysis results showed the effect of TGF-β1 inhibitor on the protein levels of Bad and Bcl-2 affected by Tet in HCT116 cells. LY364947: TGF-β1 inhibitor |
PI3K/Akt信号是调节细胞存活与抗凋亡的重要信号，也是多种抗肿瘤药物的重要靶点之一。因此，本研究对Tet抑制HCT116细胞增殖与促进凋亡是否与该信号有关进行分析。Western blot分析结果显示，Tet对Akt1/2的总蛋白水平无明显影响，但能明显降低Akt1/2/3的磷酸化水平(Fig 5A)。CCK-8测试结果显示，抑制PI3K/Akt信号，明显增强Tet对HCT116增殖的抑制作用(Fig 5B)。结果提示，Tet对HCT116细胞的增殖抑制作用可能与抑制PI3K/Akt信号有关。
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| Fig 5 Effects of PI3K/Akt on anti-proliferation effect of Tet in HCT116 cells A:Western blot analysis results showed the effect of Tet on the protein level of Akt1/2 and the phosphorylation of Akt1/2/3 in HCT116 cells; B:CCK-8 assay results showed the effect of PI3K inhibitor on Tet-induced proliferation inhibition in HCT116 cells. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs Tet.LY294002: PI3K inhibitor |
对HCT116细胞中Akt1/2/3磷酸化的影响Tet能抑制PI3K/Akt信号并促进TGF-β1表达，但Tet对PI3K/Akt信号的抑制作用是否与其促进TGF-β1表达有关尚不清楚。Western blot结果显示，外源性过表达TGF-β1能明显增强Tet对Akt1/2/3磷酸化的抑制作用(Fig 6A)，而抑制TGF-β1则部分逆转Tet抑制Akt1/2/3磷酸化(Fig 6B)。免疫荧光分析结果显示，外源性过表达TGF-β1降低Akt1/2/3的磷酸化水平，沉默PTEN明显促进Akt1/2/3的磷酸化；但沉默PTEN对Akt1/2/3磷酸化的促进作用能明显被外源性过表达TGF-β1取消(Fig 6C)。结果提示，TGF-β1介导Tet抑制HCT116细胞的增殖和促进凋亡作用可能与其抑制PI3K/Akt信号有关。
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| Fig 6 Effects of TGF-β1 and/or Tet on phosphorylation of Akt1/2/3 in HCT116 cells A:Western blot analysis results showed the effect of Tet and/or TGF-β1 on the protein level of Akt1/2 and the phosphorylation of Akt1/2/3 in HCT116 cells; B:Western blot analysis results showed the effect of Tet and/or TGF-β1 inhibitor on the protein level of Akt1/2 and the phosphorylation of Akt1/2/3 in HCT116 cells(LY364947: TGF-β1 inhibitor); C:Immunofluorescent staining results showed the effect of TGF-β1 and/or PTEN knockdown on the phosphorylation of Akt1/2/3 in HCT116 cells |
结肠癌是临床中常见的一种消化系统恶性肿瘤，具有较高的发病率和致死率，仅次于肝癌、肺癌和胃癌，每年全球约有近60万患者因结肠癌而死亡[1]。虽然目前对结肠癌的诊断和治疗都已有明显改善，但其预后仍不理想。因此，临床仍需开发高效而低毒性的抗肿瘤药物用于治疗结肠癌。本研究表明，Tet能明显抑制人结肠癌HCT116细胞增殖并促进其凋亡，这种作用可能与Tet促进TGF-β1表达，进而抑制PI3K/Akt信号活化有关；但Tet促进TGF-β1表达的具体分子机制尚不清楚。
Tet属于二苄基异喹啉类生物碱，主要从防己科植物粉防己的干燥根中提取。Tet具有多种药理活性，临床可用于治疗高血压、关节炎、神经痛、肌肉痛等相关疾病。研究表明，Tet还具有明显的抗肿瘤作用，对多种肿瘤细胞具有抗增殖和促进凋亡作用，如肝癌、乳腺癌、结肠癌等，这种作用可能与Wnt/β-catenin及p53信号等有关[5-6, 9-10]。课题组前期研究结果也证明，Tet对结肠癌具有明显抑制作用，但具体分子生物学机制尚不十分清楚。结肠癌发生与生活方式以及基因突变等因素有关，Wnt/β-catenin信号转导异常是其发生的重要原因之一[11]。除此之外，其他与结肠癌发生有关的突变包括PTEN、BRAF和KRAS等[11-12]。TGF-β超家簇包括一系列分泌性蛋白，如TGF-β、骨形态蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)、活化素(activins)以及Nodal等。这些因子与相应受体结合后，通过Smads与相应转录因子结合调节下游靶基因表达。研究表明，TGF-β功能异常也与结肠癌的发生关系密切。TGF-β有3种亚型，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。这些异构体在哺乳动物细胞中均有表达，且对肿瘤具有双向作用，既可促进肿瘤生长，也可抑制肿瘤生长[13]。出现这种情况的原因可能与肿瘤微环境、细胞种类以及细胞的分化阶段有关。TGF-β1在结肠癌表达水平较高，可通过上调Criptol-1而促进结肠癌的发展[14]。本研究结果显示，TGF-β1在结肠癌细胞中的表达水平明显高于正常结肠上皮细胞(FHC)。提示，TGF-β1在结肠癌中具有重要调节作用，但这种表达增高对结肠癌的具体影响还不十分清楚。
文献报道[15]，Tet在除草醚诱导的先天性膈疝中能抑制TGF-β1 mRNA表达，但具体机制不详。提示，Tet可能会影响TGF-β1在肿瘤细胞中表达。本研究显示，Tet在结肠癌细胞中对TGF-β1的mRNA和蛋白表达均有促进作用。由于Tet本身具有明显的抗肿瘤作用，课题组推测Tet的抗肿瘤作用可能与其上调TGF-β1表达有关。增殖抑制和凋亡检测实验结果证实，外源性表达TGF-β1能增强Tet的抗肿瘤作用，而抑制TGF-β1则明显减弱Tet的这种抗肿瘤作用。因此，Tet对结肠癌细胞的增殖抑制和促进凋亡作用可能部分通过上调TGF-β1介导，但具体作用机制不清楚。
TGF-β信号主要通过经典的TGF-β通路(TGF-β/Smads)实现对细胞增殖与分化等重要生理过程的调控。除此之外，TGF-β还可通过非经典TGF-β通路参与细胞生理功能的调节，如TGF-β可通过激活PI3K/Akt信号来促进癌细胞迁移和侵袭[16]。本研究预试验发现，Tet在结肠癌细胞中不仅未增加Smad2/3的磷酸化水平，反而抑制其磷酸化。提示，TGF-β1可能通过非经典的TGF-β信号影响Tet的抗结肠癌作用。PI3K/Akt信号与细胞的增殖、分化及凋亡关系密切。本研究结果显示，Tet能明显降低Akt1/2/3的磷酸化水平，但对Akt1/2的总蛋白水平无明显影响；抑制PI3K/Akt信号明显增强Tet抗结肠癌细胞增殖的作用。因此，Tet对Akt1/2/3磷酸化的抑制作用可能与TGF-β1过表达有关。进一步分析结果显示，外源性过表达TGF-β1明显增强Tet对Akt1/2/3磷酸化的抑制作用，而TGF-β1抑制剂则能部分逆转Tet对Akt1/2/3磷酸化的抑制作用。PTEN是PI3K/Akt信号的重要负性调节因子，沉默PTEN能明显增加结肠癌细胞中Akt1/2/3的磷酸化水平，但外源性过表达TGF-β1能取消沉默PTEN对Akt1/2/3磷酸化的促进作用。结果提示，TGF-β1表达水平增加可能通过抑制PI3K/Akt信号而介导Tet对结肠癌细胞的增殖抑制和促进凋亡作用。
体外实验结果证明，Tet具有明显的抗结肠癌作用，这种作用可能与其促进TGF-β1表达，进而抑制PI3K/Akt信号有关。TGF-β1可能是治疗结肠癌药物潜在的有效靶点之一，但Tet促进TGF-β1表达的分子机制还有待进一步研究并在其他结肠癌细胞中进行确证。
( 致谢: 本研究工作在重庆市生物化学与分子药理学重点实验室完成。感谢芝加哥大学医学中心何通川教授(T.C. He)为本研究馈赠所需的重组腺病毒。)
| [1] | Brenner H, Kloor M, Pox C P. Colorectal cancer[J]. Lancet, 2014, 383(9927): 1490-502. doi:10.1016/S0140-6736(13)61649-9 |
| [2] | Seeber A, Gastl G. Targeted therapy of colorectal cancer[J]. Oncol Res Treat, 2016, 39(12): 796-802. doi:10.1159/000453027 |
| [3] | Ling X, Liu X, Zhong K, et al. FL118, a novel camptothecin analogue, overcomes irinotecan and topotecan resistance in human tumor xenograft models[J]. Am J Transl Res, 2015, 7(10): 1765-81. |
| [4] | 杨义方, 王联亿. 汉防己甲素的药理作用研究近况[J]. 中国药理学通报, 1986, 2(4): 45-7. Yang Y F, Wang L Y. Advance in the pharmacology research of tetrandrine[J]. Chin Pharmacol Bull, 1986, 2(4): 45-7. |
| [5] | Ting C T, Li W C, Chen C Y, et al. Preventive and therapeutic role of traditional Chinese herbal medicine in hepatocellular carcinoma[J]. J Chin Med Assoc, 2015, 78(3): 139-44. doi:10.1016/j.jcma.2014.09.003 |
| [6] | 王东旭, 袁霜雪, 伍秋香, 等. 胰岛素样生长因子结合蛋白5与汉防己甲素抑制人结肠癌细胞增殖的关系研究[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(10): 1403-8. Wang D X, Yuan S X, Wu Q X, et al. Study on the relationship between insulin-like growth factor binding protein 5 and the anti-proliferation effect of tetrandrine in human colon cancer cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(10): 1403-8. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.10.016 |
| [7] | Luo J Y, Deng Z L, Luo X J, et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system[J]. Nat Protoc, 2007, 2(5): 1236-47. doi:10.1038/nprot.2007.135 |
| [8] | Han S, Bui N T, Ho M T, et al. Dexamethasone inhibits TGF-β1-induced cell migration by regulating the ERK and AKT pathways in human colon cancer cells via CYR61[J]. Cancer Res Treat, 2016, 48(3): 1141-53. doi:10.4143/crt.2015.209 |
| [9] | He B C, Gao J L, Zhang B Q, et al. Tetrandrine inhibits Wnt/beta-catenin signaling and suppresses tumor growth of human colorectal cancer[J]. Mol Pharmacol, 2011, 79(2): 211-9. doi:10.1124/mol.110.068668 |
| [10] | Meng L H, Zhang H, Hayward L, et al. Tetrandrine induces early G1 arrest in human colon carcinoma cells by down-regulating the activity and inducing the degradation of G1-S-specific cyclin-dependent kinases and by inducing p53 and p21Cip1[J]. Cancer Res, 2004, 64(24): 9086-92. doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-0313 |
| [11] | Liu Y Z, Wu K, Huang J, et al. The PTEN/PI3K/Akt and Wnt/β-catenin signaling pathways are involved in the inhibitory effect of resveratrol on human colon cancer cell proliferation[J]. Int J Oncol, 2014, 45(1): 104-12. doi:10.3892/ijo.2014.2392 |
| [12] | Riemer P, Sreekumar A, Reinke S, et al. Transgenic expression of oncogenic BRAF induces loss of stem cells in the mouse intestine, which is antagonized by β-catenin activity[J]. Oncogene, 2015, 34(24): 3164-75. doi:10.1038/onc.2014.247 |
| [13] | Neuzillet C, Tijeras-Raballand A, Cohen R, et al. Targeting the TGFβ pathway for cancer therapy[J]. Pharmacol Ther, 2015, 147: 22-31. doi:10.1016/j.pharmthera.2014.11.001 |
| [14] | Mancino M, Strizzi L, Wechselberger C, et al. Regulation of human Cripto-1 gene expression by TGF-beta1 and BMP-4 in embryonal and colon cancer cells[J]. J Cell Physiol, 2008, 215(1): 192-203. doi:10.1002/jcp.v215:1 |
| [15] | Xu C, Liu W, Chen Z, et al. Effect of prenatal tetrandrine administration on transforming growth factor-beta1 level in the lung of nitrofen-induced congenital diaphragmatic hernia rat model[J]. J Pediatr Surg, 2009, 44(8): 1611-20. doi:10.1016/j.jpedsurg.2008.09.021 |
| [16] | Vo B T, Morton D Jr, Komaragiri S, et al. TGF-beta effects on prostate cancer cell migration and invasion are mediated by PGE2 through activation of PI3K/AKT/mTOR pathway[J]. Endocrinology, 2013, 154(5): 1768-79. doi:10.1210/en.2012-2074 |