2. 漯河医学高等专科学校 药理学教研室，河南 漯河 462002
2. Dept of Pharmacology, Luohe Medical College, Luohe Henan 462002, China
研究显示，拓扑异构酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ, Top Ⅱ)涉及多种恶性肿瘤，与癌细胞中DNA复制、转录和染色质重塑相关，是一个重要的化疗靶点，而且Top Ⅱ抑制剂在化疗中非常有效，已作为多种恶性肿瘤的预后标记物[1]。因此，DNA Top Ⅱ是一个筛选抗癌剂重要靶点。目前，Top Ⅱ抑制剂已被用于人类恶性肿瘤临床治疗，但大多数Top Ⅱ抑制剂易产生心脏毒性、多药物抵抗等严重的副作用[2]。因此，寻求一种毒性和副作用较少的Top Ⅱ靶向药物迫在眉睫。本课题组前期研究表明，马鞭草总黄酮(total flavonoids of Verbena officinalis L, TFV)能抑制肝癌HepG-2细胞的增殖，诱导细胞凋亡[3-4]，本研究重点考察不同剂量的TFV对肝癌HepG-2细胞凋亡、Top Ⅱ表达的影响。
1 材料与方法 1.1 细胞株人肝癌HepG-2细胞购自武汉博士德有限公司。
1.2 药物与试剂芦丁对照品(南京泽朗医药科技有限公司)，纯度:＞98%；TFV (漯河医专天然药物化学教研室)，以芦丁为标准品，高效液相色谱法在检测波长510 nm测得总黄酮含量约为81%，溶于适量二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)中，培养基稀释成不同浓度，过滤除菌4 ℃保存；DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物技术公司)；胰酶(美国Gibco公司)；DNA TopoⅡ(美国USB公司)；质粒pBR 322DNA(Fermentas公司)；Dead end TM TUNEL荧光法检测系统(美国普洛麦格公司)；TOPO Ⅱα、TOPO Ⅱβ兔抗人抗体(美国Abcam公司)；caspase-3、Bcl-2、Bax兔抗人抗体、HRP标记的羊抗兔IgG二抗及β-actin抗体(美国Sigma公司)。
1.3 仪器ST-360酶联免疫检测仪(上海科华实验系统有限公司)；Geldoc 2000凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；light cycleR 96实时荧光定量PCR仪(德国Roche Diagnostics公司)。
1.4 方法 1.4.1 细胞培养HepG-2细胞株由漯河市医学生物工程重点实验室传代保种，用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2条件下培养，0.25%的胰蛋白酶消化。
1.4.2 TUNEL-DAPI双染色法检测细胞凋亡取对数期HepG-2细胞，以1×108·L-1的密度接种于6孔培养板内，各孔事先加入已清洗干净的盖玻片，细胞贴壁后，参照前期研究设置[3-4]质量浓度为50、100、200 mg·L-1的TFV组，对照组给予等量培养液，每组设置3个平行孔，培养48 h后，弃去上清，PBS漂洗2次。参照TUNEL试剂盒说明书，采用4%多聚甲醛固定、0.2% Triton X-100通透，加入TUNEL反应混合液(TdT和荧光素标记的dUTP)，37 ℃孵育60 min，PBS漂洗2次，每次5 min，加DAPI 4 min，PBS漂洗2次，每次5 min，封片。荧光显微镜下观察，每个玻片随机选择10个视野，计数凋亡细胞，计算凋亡率。凋亡率/%=(阳性细胞数/细胞总数)×100%。
1.4.3 超螺旋pBR322 DNA松弛实验DNA拓扑异构酶Ⅱ活性采用超螺旋pBR322 DNA松弛实验测定，将0.2 μg pBR322 DNA与1U TopⅡ和不同浓度的TFV在20 μL反应缓冲液[10 mmol·L-1 Tris(pH 7.9)、50 mmol·L-1 KCl、50 mmol·L-1 NaCl、5 mmol·L-1 MgCl2、0.1 mmol·L-1 EDTA、15 mg·L-1 BSA、1 mmol·L-1 ATP]37℃反应30 min。然后，加入2 μL终止液(10% SDS和100 mmol·L-1 EDTA)终止反应。样品在0.8%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液120 V电泳60 min，0.5 mg·L-1溴化乙锭染色15 min，凝胶成像系统观察并拍照。
1.4.4 Real time PCR将药物处理48 h的细胞(TFV 50、100、200 mg·L-1组和对照组)，TRIzol提取总RNA，测定纯度。按照逆转录试剂盒说明书逆转录生成cDNA。引物序列由上海英骏公司提供。TOP Ⅱα上游序列：5′-GCGGGCTAAAGGAAGGTTCA-3′，下游序列：5′-TGACACTTCCATGGTGACGG-3′，产物大小151 bp；TOP Ⅱβ上游序列：5′-CGTCCGCTCCGGATCTTCG-3′，下游序列：5′-CACCCACATGAACTGCGTCA-3′，产物大小408 bp；内参GAPDH上游引物：5′-CTCCTGTTCGACAGTCAGCC-3′，下游引物：5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′，长度262 bp。PCR采用20 μL的反应体系，其中2×SYBRR Premix Ex-Taq Ⅱ 10 μL，上游(10 μmol)和下游(10 μmol)各0.5 μL，cDNA 1 μL，PCR级高纯水8 μL。采用light cycleR 96实时荧光定量PCR仪同时对目的基因和内参基因(GAPDH)进行基因扩增。采用Ct值计算基因的相对表达量，相对表达量=2-△△Ct×100%，△Ct=Ct(待测基因)-Ct(GAPDH)。
1.4.5 Western blot方法检测凋亡相关蛋白的表达收集TFV处理48 h后的细胞，常规提蛋白，考马斯亮蓝染色法测总蛋白的量，10% SDS-PAGE分离，PVDF膜转膜，5%山羊血清(PBS稀释)封闭；加入1 :3 000、1 :2 000、1 :2 000、1 :2 000、1 :2 000稀释(体积分数为1% BSA-PBS稀释)的Bcl-2、Bax、TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ和caspase-3一抗，1 :1 000稀释的β-actin，4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔)，室温孵育1 h。行ECL反应，显色。Bio-Rad凝胶成像系统拍照，GIS凝胶成像分析软件分析。
1.5 统计学处理统计学分析采用GraphPad Prism5软件，数据采用x±s表示，两组数据采用t检验，多组数据采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 马鞭草总黄酮对肝癌HepG-2细胞凋亡的影响质量浓度分别为50、100、200 mg·L-1马鞭草总黄酮作用于肝癌HepG-2细胞48 h时，细胞凋亡率较对照组明显增加(Fig 1、2)，差异均有统计学意义(P < 0.05)。
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| Fig 1 TUNEL staining of HepG-2 cells following 48 h treatment with TFV(×200) A: 0 mg·L-1 TFV treated group; B: 50 mg·L-1 TFV treated group; C:100 mg·L-1 TFV treated group; D: 200 mg·L-1 TFV treated group |
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| Fig 2 Apoptotic rate of HepG-2 cells treated with TFV(x±s, n=3) **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs 50 mg·L-1 TFV treated group |
Fig 3结果显示，泳道5为负超螺旋pBR322 DNA；泳道1为加TOP Ⅱ反应后，负超螺旋全部转化为松弛型DNA；加入50、100、200 mg·L-1的马鞭草总黄酮后，解旋的DNA明显减少，DNA保持超螺旋状态，并呈现剂量效应。
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| Fig 3 Effect of TFV on DNA TOP Ⅱ activity in HepG-2 cells 1: 0.2 μg pBR322 DNA; 2~4:0.2 μg pBR322 DNA and TFV at 200, 100, 50 mg·L-1 +1 U TOP Ⅱ; 5: 0.2 μg pBR322 DNA+1 U TOP Ⅱ; R:Relaxed DNA; S: Supercolid DNA |
马鞭草总黄酮处理肝癌HepG-2细胞48 h后，TOP Ⅱα mRNA表达量较对照组明显下降，差异均有统计学意义(P < 0.05)，同样TOP Ⅱβ mRNA表达量较对照组明显下降(Fig 4)，差异均有统计学意义(P < 0.05)。
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| Fig 4 Effect of TFV on expression of DNA TOP Ⅱ mRNA in HepG-2 cells(x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs 50 mg·L-1 TFV treated group |
质量浓度分别为50、100、200 mg·L-1的马鞭草总黄酮处理HepG-2细胞48 h后, Bcl-2、TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ蛋白表达量均较对照组明显下降，Bax、caspase-3蛋白水平明显升高，差异均有统计学意义(P < 0.05)；质量浓度200 mg·L-1的马鞭草总黄酮作用于HepG-2细胞48 h后，Bcl-2、TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ、Bax、caspase-3蛋白变化幅度较对照组更加明显(Fig 5、6)，差异均有统计学意义(P < 0.05)。
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| Fig 5 Expression of apoptotic protein detected by Western blot |
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| Fig 6 Effect of TFV on expression of apoptotic protein in HepG-2 cells(x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs 50 mg·L-1 TFV treated group |
TopⅡ为存在于细胞核中的一种重要的酶，由TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ两种亚基组成，通过识别特殊的DNA序列选择性切断DNA双链，协调超螺旋和解螺旋相互转变，调节DNA拓扑异构化。研究显示，部分肿瘤细胞中TopoⅡ水平活性明显高于正常组织细胞，因此，通过干扰TopoⅡ调节DNA的断裂和连接，诱导肿瘤细胞凋亡是目前抗肿瘤重要机制，其中临床抗肿瘤药物依托泊苷和替尼泊苷就是以TopoⅡ作为作用靶点进行药物治疗[5]。Priyadarshani等[6]研究发现，黄酮和异黄酮能以拓扑异构酶Ⅱα为靶点，对各种癌细胞产生细胞毒性，对正常细胞低毒性、无凋亡作用。而Sudan等[7]发现，来源于苹果皮的黄酮能停滞HepG-2细胞细胞周期，并通过抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ活性诱导凋亡。本研究结果表明，马鞭草总黄酮能抑制TOP Ⅱα和TOP Ⅱβ mRNA表达量，提示马鞭草总黄酮可能通过和TopⅡ直接结合，抑制TopⅡ的活性，并影响HepG-2细胞DNA复制转录过程，最终影响TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ mRNA的转录水平，而且通过琼脂糖凝胶电泳也说明马鞭草总黄酮能抑制TopoⅡ的活性，并呈现明显的剂量效应。与此相对应的是，马鞭草总黄酮也能降低HepG-2细胞内TopoⅡα、TopoⅡβ蛋白表达水平，提示马鞭草总黄酮均可与RNA和DNA结合，并对TopoⅡα、TopoⅡβ蛋白表达水平产生影响，并进一步抑制HepG-2细胞内DNA的解旋，诱导细胞凋亡。
在细胞凋亡环节中，Bcl-2家族在caspase激活通路，尤其是线粒体途径中发挥了极为重要的调控作用。Bcl-2是一种存在于线粒体内膜蛋白，能通过增强线粒体膜电位，抑制钙离子释放，阻止核酸内切酶活化，并发挥抗凋亡作用[8]。此外，Bcl-2为活化的caspase-3作用底物之一，激活的caspase-3可以降解Bcl-2表达，因此，Bcl-2表达水平也能间接反映caspase-3活性。Bax属于Bcl-2家族成员，与Bcl-2作用相反，可直接激活死亡效应因子caspase-3或改变细胞膜通透性，引起细胞色素C释放，激活caspase-3活性，启动caspase级联反应[9]。Feng等[10]研究发现，狭基线纹香茶菜总黄酮能通过线粒体途径下调Bcl-2表达水平，启动细胞凋亡。Wang等[11]研究显示，来自金莲花总黄酮能下调Bcl-2水平，上调caspase-3表达水平，启动线粒体凋亡。本研究结果显示，马鞭草总黄酮能下调HepG-2细胞中Bcl-2蛋白水平，上调caspase-3以及Bax活性，并呈现明显的剂量效应，提示马鞭草总黄酮能通过调控Bcl-2家族蛋白，并对caspase-3产生激活作用，从而通过有效的调控酶联反应，启动线粒体凋亡，质量浓度越高，调节作用越明显。
总之，马鞭草总黄酮抑制TopoⅡ活性是诱导HepG-2细胞凋亡的直接因素，并通过Bcl-2/Bax/caspase-3信号通路启动级联反应，是其体外抗肿瘤作用的重要分子机制，而且马鞭草总黄酮主要来源于中成药马鞭草，为天然的抗炎、抗肿瘤药物，具有高效低毒的特点，且马鞭草资源丰富，临床应用无毒副作用[12]，可以为马鞭草总黄酮的开发提供参考。
( 致谢: 本实验在河南省漯河市医学生物工程重点实验室完成，感谢实验室所有成员对本实验的支持和帮助！)
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