2. 河北医科大学第二医院免疫风湿科，河北 石家庄 050000;
3. 河北省人民医院医院感染管理科，河北 石家庄 050000
2. Dept of Rheumatology, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China;
3. Dept of Nosocomial Infection Control, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050000, China
狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)是系统性红斑狼疮常见并发症之一，也是其主要的致死原因，其在国内的发病率逐年攀升，但因具体作用机制并不清楚，治愈率很低[1]。因此，对其作用机制的研究尤为重要。
高迁移率族蛋白1(high mobility group protein B1，HMGB1) 是一种非组蛋白染色质结合蛋白，参与DNA的转录及修饰等生物学功能。新近研究发现，HMGB1作为炎症因子参与了呼吸系统、肝脏、肿瘤及自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、干燥综合征等多种疾病的发生[2-4]，其在系统性红斑狼疮中的作用也得到越来越多的重视[5]，但HMGB1在LN中发挥了何种作用尚不明确。
之前我们的研究发现在小鼠系膜细胞中，HMGB1能够活化NF-κB信号通路，从而促进系膜细胞的增殖[6]，但在LN患者及人类系膜细胞中是否也存在相似作用仍是未知。此外，我们近来研究发现，在LN患者外周血中肿瘤坏死因子-α-诱导蛋白-3(tumor necrosis factor α-induced protein 3，TNFAIP3) mRNA表达水平明显升高。TNFAIP3作为炎症反应负向调节的关键分子，是一种表达于多个免疫器官的诱导性胞质蛋白，该基因既具有泛素化酶又具有去泛素化酶的功能[7]，以往研究发现其表达水平异常可能与NF-κB的功能异常有关。然而，TNFAIP3是否与HMGB1共同参与调控NF-κB的活性，从而参与LN的发生发展目前仍不清楚。
因此，本实验拟以Ⅳ型LN患者及人肾小球系膜细胞(human mesangial cell, HMC)为研究对象，通过对HMGB1及TNFAIP3相关信号通路的研究，探讨HMGB1和TNFAIP3在LN肾小球系膜细胞过度增殖中的作用。
1 材料与方法 1.1 材料采用癌旁远端正常组织和LN患者肾组织各15例，实验已经过伦理委员会核准，由河北医科大学第二医院提供。人系膜细胞系购自中南大学高等研究中心。兔抗HMGB1单克隆抗体(Abcam公司，货号ab79823)，兔抗TNFAIP3多克隆抗体(ABclonal公司，货号A2127)，兔抗IkBα单克隆抗体(Abcam公司，货号ab32518)，兔抗p65多克隆抗体(Abcam公司，货号ab90532)，SP法免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号SP9001)，Dylight 649-山羊抗兔荧光二抗(KPL公司，货号072051806)，BrdU参入试剂盒(Merck Millipore公司，货号2752)。
1.2 分组肾穿样本分为正常组织对照组和LN患者组。细胞分组：采用人重组HMGB1蛋白刺激HMC细胞，对细胞增殖水平影响的研究分为空白对照组和不同浓度刺激组，收集不同浓度刺激后各个时间点的细胞；对蛋白表达水平影响的研究分为空白对照组和不同时间点刺激组。
1.3 免疫组化肾组织脱蜡至水；3%过氧化氢避光孵育20 min，0.01 mmol·L-1枸橼酸修复液，高压修复5 min并自然晾凉；正常山羊血清37℃封闭60 min；滴加抗TNFAIP3或IκBα抗体(1 :200稀释)4℃过夜；二抗37℃孵育30 min；三抗37℃孵育30 min；DAB显色液显色5 min；苏木精染色2 min；氨水返蓝30 s，盐酸酒精分化30 s；脱水透明，中性树胶封片。
1.4 免疫荧光肾组织脱蜡至水；0.01 mmol·L-1枸橼酸修复液，高压修复5 min；正常山羊血清37℃封闭60 min；滴加抗HMGB1抗体(1 :200稀释)，4℃过夜；0.01 mmol·L-1 PBS洗涤3次，每次5 min；TRITC-山羊抗兔IgG(1 :200稀释)37℃孵育60 min(避光)；DAPI复染；荧光显微镜下观察结果。免疫荧光染色结果判定：HMGB1蛋白阳性信号均呈红色荧光。
1.5 BrdU参入法检测细胞增殖水平HMC细胞以1×105/孔接种于96孔板，用50、100、200μg·L-1的人重组HMGB1蛋白刺激细胞，每组设立3个复孔。37℃、5% CO2孵箱中培养2、4、8、12 h；收集细胞前1 h，每孔加入100 μL BrdU参入液；收集细胞，每孔加入固定液200 μL，室温孵育30 min；Washing Buffer冲洗3次；每孔滴加抗BrdU抗体100 μL，室温放置1 h，Washing Buffer冲洗3次；每孔滴加二抗100 μL，室温孵育30 min，Washing Buffer冲洗3次, 滴加过氧化物酶底物每孔100 μL，室温孵育30 min，此时增殖活跃的细胞孔呈蓝色。每孔加入终止液100 μL，细胞孔由蓝色变为亮黄，酶标仪于450 nm处检测其OD值。
1.6 Western blot采用100 μg·L-1人重组HMGB1蛋白刺激HMC，收集刺激后0、10、20、30、40、50、60 min各时间点的细胞，裂解后，采用BCA试剂盒进行蛋白定量，煮沸5 min变性。50 μg样品进行10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白分离后湿转至PVDF膜。5%脱脂奶粉37℃封闭1 h。加入TNFAIP3、IκBα或p65抗体(稀释浓度均为1 :1 000)4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释浓度为1 :5 000)37℃孵育2 h。Odyssey FC成像系统显影，并对条带进行定量分析，以目的条带和β-actin条带积分光密度值(IOD值)的比值代表目的蛋白的相对表达量。
1.7 统计学分析计量资料用x±s表示，采用SPSS 18.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，并进行两两比较。
2 结果 2.1 肾组织中HMGB1、TNFAIP3和IκBα蛋白的表达水平免疫荧光结果提示，与对照组癌旁远端正常组织相比，LN患者肾小球HMGB1蛋白(红色)阳性细胞比例明显升高，且主要定位于细胞核(Fig 1A、1B)。免疫组化结果提示，与对照组相比，TNFAIP3蛋白表达水平升高(Fig 1C、1D)，IκBα蛋白表达水平降低(Fig 1E、1F)，二者均定位于细胞质。
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| Fig 1 HMGB1, TNFAIP3 and IκBα expression levelsin glomerular cells of type Ⅳ LN patients and normal tissuesby immunofluorescence and immunohistochemistry technique A~B:Immunofluorescence of HMGB1 expression; C~D:Immunohistochemistry of TNFAIP3 expression; E~F:Immunohistochemistry of IκBα expression |
LN患者体内存在HMGB1的上调，该上调是否与细胞增殖有关呢？我们进一步采用HMGB1重组蛋白对人类的系膜细胞(HMC)进行刺激，BrdU参入结果提示，与对照组相比，100、200 μg·L-1 HMGB1刺激HMC 8、12 h后，HMC增殖水平均明显升高(P < 0.05)，二者之间无明显差异(Fig 2)。
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| Fig 2 HMC proliferation levels increased significantlyafter HMGB1 stimulation using BrdU incorporation technology *P < 0.05 vs control |
是否由于HMGB1的上调引起TNFAIP3表达量的变化，从而影响了NF-κB信号通路的活化水平呢？我们采用HMGB1重组蛋白对HMC在不同时间点进行刺激，研究TNFAIP3的表达情况。结果显示，与对照组相比，人重组HMGB1刺激10 min后，HMC中TNFAIP3蛋白表达水平明显增加(P < 0.05)，见Fig 3。而IκBα蛋白表达水平与TNFAIP3正好相反，与对照组相比，人重组HMGB1刺激30 min后，HMC中IκBα蛋白表达明显降低(P < 0.05)，见Fig 4。p65蛋白表达水平与IκBα相反，与对照组相比，刺激40 min后，明显升高(P < 0.05)。提示TNFAIP3可能参与HMGB1诱导的HMC中NF-κB信号通路的活化，从而促进细胞增殖。
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| Fig 3 TNFAIP3 protein expression levelincreased 10, 20, 30 min after HMGB1 stimulation *P < 0.05 vs control |
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| Fig 4 IκBα protein expressionlevel decreased, while p65 increased significantly30 min and 40 min after HMGB1 stimulation *P < 0.05 vs control |
LN是系统性红斑狼疮最常见、最严重的并发症，但其发病机制尚未清楚。细胞免疫及体液免疫功能紊乱导致多种细胞因子分泌失衡，并通过相互协同或拮抗作用参与多种组织和器官的损伤[8]，其中HMGB1的作用得到越来越多的关注。HMGB1是一种非组蛋白染色质结合蛋白，我们的前期实验证实了HMGB1在小鼠狼疮性肾炎中异常表达[6, 9]，提示HMGB1可能参与了LN的发病过程，但是具体机制如何仍不十分清楚。
肾小球细胞的增殖是LN的主要病理特征之一，也是其肾脏病理的活动性指标。我们以往研究发现，在小鼠系膜细胞中HMGB1可能促进肾小球细胞增殖，参与疾病发生[6, 10]。本研究也证实了HMGB1在LN患者肾小球细胞中，尤其是系膜区细胞中存在表达水平的上调；体外实验则证实了人重组HMGB1能够诱导HMC增殖水平的升高。这些结果提示HMGB1可能在LN的发病过程中发挥了重要作用，而这一作用是通过促增殖作用实现的。那么，HMGB1又是如何发挥作用的呢？
HMGB1可能是通过激活细胞内信号通路发挥其功能的。其中，NF-κB信号通路与免疫性疾病的关系最为密切[11-12]。正常情况下，NF-κB与IκB组成三聚体处于失活状态。IκB蛋白的降解使NF-κB从三聚体中得以释放，并被转移至细胞核中发挥其核转录因子作用。在这个过程中，IκBα的降解是整个信号通路的中心环节之一。在本研究中，我们证实了在LN患者肾小球细胞胞质内确实存在着IκBα蛋白表达水平的降低，提示IκBα有可能遭到降解，泛素化是常见的蛋白降解途径之一。我们对多种泛素连接酶进行了筛选，结果发现TNFAIP3在LN患者中表达水平明显升高。TNFAIP3是一种表达于多个免疫器官的诱导性胞质蛋白，该基因既具有泛素化酶又具有去泛素化酶的功能，因而在免疫调节、抑制肿瘤、TNF介导的细胞凋亡等方面均具有重要作用[7]。有研究证实其与NF-κB-IκB三聚体的关系密切[13]，能够抑制NF-κB的活化，是重要的炎症抑制因子，而且TNFAIP3与风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的关系也十分密切[14]。但是TNFAIP3在LN进展中的作用仍不十分明了，我们在研究中发现，与对照组相比，TNFAIP3在LN患者肾小球中的表达出现上调，推测TNFAIP3表达水平的变化可能是由HMGB1所介导的。
因此，我们以人重组的HMGB1刺激HMC，结果发现TNFAIP3表达水平迅速升高，随后我们检测到了IκBα蛋白表达水平的下调，p65蛋白表达水平明显增加。以上实验结果均提示，HMGB1可能通过上调TNFAIP3蛋白表达水平，影响IκBα的表达水平，诱发NF-κB信号通路的活化，介导系膜细胞过度增殖，从而参与LN的发病。以往研究认为TNFAIP3为NF-κB的负调节因子[15]，但是在LN中TNFAIP3的具体作用尚不明确，因此，是否有其他的因素影响其负调控作用仍是未知[16]。总之，TNFAIP3是如何影响IκBα表达水平，其具体作用机制有待进一步研究。
综上所述，本研究证实了HMGB1和TNFAIP3在LN肾小球系膜细胞过度增殖中的重要作用，为揭示LN的发病过程提供了新的依据，同时为其靶向治疗提供了新的思路。
( 致谢: 本实验在河北省肾脏病重点实验室、河北医科大学病理实验室完成，特此致谢! )
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