2. 南方医科大学 南方医院古中医科，广东 广州 510515
2. School of Traditional Chinese Medicine, Dept of Ancient Traditional Chinese Medicine, Nanfang Hospital, Guangzhou 510515, China
鼻咽癌是中国南方地区高发的一种恶性肿瘤，由于鼻咽癌组织中有10%~20%细胞对放疗射线抗拒，导致放疗后仍有局部残留或复发，继而降低治疗效果[1]。本实验通过照射诱导人低分化鼻咽癌放射敏感株CNE-2获得鼻咽癌放射抗拒株CNE-2R，并用姜黄素联合放射作用于两株细胞，从而初步探讨姜黄素对鼻咽癌抗拒株的放射增敏作用及其机制。
1 材料与方法 1.1 细胞株与试剂人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2(中山大学肿瘤防治中心惠赠)；RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS, 美国Gibco公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT, Sigma公司]；姜黄素对照品(中国曼斯特公司)；流式试剂盒(中国碧云天公司)；逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)；SYBR Green试剂盒(美国Life)。
1.2 细胞培养根据本课题组以往的研究基础[2]，选用X射线敏感株鼻咽癌细胞CNE-2用于本实验。细胞贴壁生长，用含体积分数10% FBS的RPMI 1640完全培养基在37 ℃、体积分数5% CO2、饱和湿度的孵箱培养。每天换液，细胞生长到培养瓶70%~80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。
1.3 照射方法取对数生长期CNE-2细胞种植贴壁后，南方医院放疗科直线加速器6MV X射线照射，照射野为25 cm×25 cm，源皮距100 cm，剂量率548 cGy·min-1，并给1 cm厚的玻璃补偿，总剂量6 Gy。照射完成待细胞长满后，传代培养。传代2~3次待细胞状态稳定后，重复以上过程进行下次照射。共间歇性照射7次6 Gy后，再增大剂量率至10 Gy·min-1后，间歇性给20 Gy照射3次。如此重复照射传代至细胞形态、增殖状况稳定，即可得到较稳定抗拒株CNE-2R。
1.4 MTT法检测细胞生长取CNE-2R对数生长期细胞，种植96孔板。细胞浓度为5.0×107·L-1，每孔100 μL(细胞数为5.0×103个)，每组细胞设6个平行对照孔。细胞放入孵箱培养24 h后，按浓度梯度(40、30、20、10、5、2.5、0 μmol·L-1)给予配制好的浓度为80 mmol·L-1的姜黄素DMSO溶液，并增加0.1% DMSO对照组。给药24 h后，加5 g·L-1 MTT溶液11 μL，放回孵箱继续培养。4 h后，小心吸去每孔上层液体，再加入100 μL分析纯二甲基亚砜(dimethyl sulfoxid, DMSO)，振摇10 min。M550酶标仪在490 nm波长下测量每孔的吸光度。根据每天不同细胞吸光度的均值作出细胞生长曲线。
1.5 克隆生存实验① 放射组(8、6、4、2、1、0 Gy); ② 姜黄素+放射组：10 μmol·L-1姜黄素处理24 h后，再分别进行照射(8、6、4、2、1、0 Gy)。每组设3个平行对照孔。取CNE-2R细胞种板后，分别给药24 h，照射完成后换液，并放回孵箱继续培养。10~14 d后弃去培养液，每孔4 mL PBS溶液清洗2次，加入2 mL甲醇，固定30 min，每孔4 mL PBS溶液清洗2次，每孔加入2 mL 0.1%的吉姆萨染液染色30 min。回收吉姆萨染液，蒸馏水洗板并晾干，计数所形成的集落数(≥50个细胞数为有效集落)，得出集落形成率(PE)，根据下列公式计算不同剂量照射下的存活分数(SF)，重复3次实验。
存活分数(SF)=实验组集落形成率/对照组集落形成率；集落形成率(PE)=形成集落数/种植细胞数。
在GraphPad Prism软件中，根据不同的照射剂量和该剂量下的存活分数(SF)，运用单击多靶模型和线性二次(L-Q)模型拟合，计算相关放射增敏参数值。
1.6 细胞周期检测① 敏感株CNE-2组; ② 抗拒株CNE-2R组; ③ 姜黄素+抗拒株CNE-2R组：10 μmol·L-1姜黄素处理24 h。收集细胞并计数，调浓度为1.0×109·L-1。取该浓度细胞悬液3 mL，PBS溶液洗2次后，用70%乙醇溶液固定，4℃过夜，离心弃上清，PBS冲洗后，用含100 mg·L-1碘化丙啶(propidium iodide，PI)和100 mg·L-1 RNase酶的0.5 mL PI染液，4℃条件下避光染色30 min。用美国BD Biosciences公司流式细胞仪检测细胞周期。
1.7 RT-qPCR检测细胞周期及DNA损伤修复相关基因的表达① 敏感株CNE-2组; ② 抗拒株CNE-2R组; ③ 姜黄素组+抗拒株CNE-2R组：10 μmol·L-1姜黄素处理24 h。3组细胞分别用TRIzol提取总mRNA (步骤按说明书进行)，将mRNA逆转录成cDNA，将内参GAPDH及目的基因进行PCR扩增。GAPDH及目的基因引物根据Primer Premier 5.0软件自行设计，并由赛默飞公司合成。具体引物序列见Tab 1。
| Gene | Primer sequence(5'-3') |
| ERCC2 | F：GTGCCCATACTTCCTTGCTC |
| R：TCGATGCAGACGTTGTCAAT | |
| GADD45g | F：GACACAGTTCCGGAAAGCAC |
| R：AGAAAGCCTGGATCAGCGTA | |
| BBC3 | F：GAAATTTGGCATGGGGTCT |
| R：AGAGGCCGCAGGACACTG | |
| BRCA1 | F：GAAAGGGCCTTCACAGTGTC |
| R：TCCAAACCTGTGTCAAGCTG | |
| CDK4 | F：CCCGAAGTTCTTCTGCAGTC |
| R：CTGGTCGGCTTCAGAGTTTC | |
| GAPDH | F：ATCATCAGCAATGCCTCCTG |
| R：ATGGACTGTGGTCATGAGTC |
采用SPSS 11.0统计软件包，实验数据以x±s表示，均数检验先用方差分析，再用两两检验。
2 结果 2.1 细胞生长曲线给药24 h时，浓度大约在10 μmol·L-1之后，随着姜黄素浓度的增加，其对鼻咽癌细胞CNE-2R的抑制作用明显增加。而给药48 h时，则在5 μmol·L-1的之后就表现出一定的抑制作用。表明姜黄素对鼻咽癌细胞CNE-2的抑制作用呈一定的时间、剂量依赖性。见Fig 1。
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| Fig 1 Effects of different concentrationsof curcumin on growth of CNE-2R |
根据细胞生长曲线结果，本文选择对鼻咽癌细胞CNE-2R无明显生长抑制作用时的最大姜黄素浓度10 μmol·L-1作用24 h。结果发现，与单纯的放射组相比，姜黄素与放射联合组的K值由0.306增加至0.472，N值由1.60降低至1.06，D0值由3.27降低至2.12，Dq值由1.53降低至0.12，SF2值由1.93降低至0.361，α值由0.124增加至0.450，β值由0.018 9降低至0.000 282，α/β值由6.56增加至1 596，放射增敏比计算为1.54。单击多靶模型和L-Q模型在GraphPad Prism软件中拟合的生长曲线见Fig 2、3。相关放射生物学参数见Tab 2。
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| Fig 2 Dose-survival curve obtained frommulti-target single-hit model matching |
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| Fig 3 Dose-survival curve obtained from L-Q matching |
| Group | K | N | D0 | Dq | SF2 | α | β | α/β | SER |
| Radiation+Curcumin | 0.472 | 1.06 | 2.12 | 0.12 | 0.361 | 0.450 | 0.000 282 | 1 596 | 1.54 |
| Radiation | 0.306 | 1.60 | 3.27 | 1.53 | 1.93 | 0.124 | 0.018 9 | 6.56 | - |
抗拒株CNE-2R与敏感株CNE-2比较，G1、S期均明显增多(P < 0.05)，G2期则明显减少(P < 0.05)。经过10 μmol·L-1姜黄素处理24 h后，抗拒株CNE-2R的G1期轻微减少，G2期明显增多(P < 0.05)，S期明显减少(P < 0.05)。而将给药后的抗拒株CNE-2R与敏感株CNE-2比较发现，G1期明显增多(P < 0.05)，G2期明显减少(P < 0.05)，S期轻微增多。见Fig 4、Tab 3。
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| Fig 4 Cell cycle of three group cells A:CNE-2;B:CNE-2R;C:CNE-2R+Curcumin; D:Statistical figure. *P < 0.05 vs CNE-2;#P < 0.05 vs CNE-2R |
| Group | G1 | G2 | S |
| CNE-2 | 39.86±2.77 | 41.91±2.47 | 19.12±1.36 |
| CNE-2R | 53.94±2.56* | 11.17±1.39* | 32.67±1.42* |
| CNE-2R+Curcumin | 50.86±1.80* | 33.03±2.30*# | 22.13±1.90# |
| *P < 0.05 vs CNE-2；#P < 0.05 vs CNE-2R | |||
抗拒株CNE-2R组与敏感株CNE-2组相比，ERCC2、BBC3、GADD45g、BRCA1基因表达明显上调(P < 0.05)，CDK4基因的表达明显下调了(P < 0.05)。而用10 μmol·L-1姜黄素处理24 h后，抗拒株CNE-2R组的CDK4基因的表达明显上调(P < 0.05)，GADD45g、BRCA1基因的表达明显下调(P < 0.05)。将姜黄素处理后的抗拒株CNE-2R组与敏感株CNE-2比较发现，CDK4基因的表达差异无显著性，GADD45g、BRCA1基因的表达则明显下调(P < 0.05)。见Fig 5。
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| Fig 5 Fold change of genes *P < 0.05 vs CNE-2; #P < 0.05 vs CNE-2R |
放射抗拒性会导致鼻咽癌细胞对放射治疗失去敏感度，加之放射治疗本身对基因稳定性的影响，从而导致鼻咽癌的易复发与转移。在本研究中，我们对鼻咽癌CNE-2细胞系进行研究，因其对辐射敏感且为病理低分化细胞，与大多数鼻咽癌细胞特征相仿，所以，以CNE-2为研究细胞对临床有更大的参考作用。
生存克隆实验可以真实反映照射后细胞的存活分数，故而常被用于测定细胞的放射敏感性。在Kellerer和Rossi于1972年提出的细胞剂量-存活曲线线性平方模型(L-Q模型)中，公式S=exp(-αD-βD2)中的常数α代表低剂量照射对细胞的损伤程度，常数β代表效应的超线性部分。α/β值越大，则表明细胞修复能力越弱，而细胞修复能力能直接影响到细胞的放射敏感性。2 Gy时存活分数SF2越大，放射抗拒性越强[3-4]。在电离辐射敏感性的研究最常用的多靶单击模型中，N值反映细胞对放射损伤的修复能力，N值越大，修复能力越大，细胞抗拒性越强。D0越大，放射抗拒性越强。Dq为细胞放射受损准阈剂量，Dq增大，细胞抗拒性增强[5]。本研究发现，10 μmol·L-1姜黄素处理24 h后，抗拒株CNE-2R的α/β值从6.56增加到1 596；SF2从1.93 Gy减少到0.361 Gy；N值从1.60减少到1.06；D0值从3.27减少到2.12；Dq值从1.53减少到0.12。说明10 μmol·L-1姜黄素能有效增加抗拒株CNE-2R的放射敏感性。
由于在不同周期的细胞对射线敏感度不同，G2/M期最敏感，G1/G0期相对敏感，S期最不敏感，如果放射敏感期的细胞增多，那么放射抗拒性就减弱。本研究发现10 μmol·L-1姜黄素处理24 h后，抗拒株CNE-2R细胞G2期明显增多(P < 0.05)，G1期稍微减少，S期明显减少(P < 0.05)。说明姜黄素是通过改变抗拒株的细胞周期，出现G2期阻滞，从而增加抗拒株CNE-2R的敏感性。
Zhu等[6]认为通过p53能诱导产生细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡。同样在Jelena等[7]的研究中也发现G2期阻滞会导致诱导细胞凋亡的放射剂量增加，而其中涉及的相关基因改变包括p53、Bax、Bcl-2。本研究中, 为了初步了解姜黄素对鼻咽癌抗拒株CNE-2R细胞的放射增敏作用的机制，通过RT-qPCR检测细胞周期及DNA损伤修复相关基因发现，姜黄素可能是通过调控GADD45g、CDK4、BRCA1基因的表达来增加抗拒株CNE-2R细胞的放射敏感性。在p53通路中GADD45g可以引起G2期阻滞[8]，CDK4可以引起G1期阻滞[9]。这与本实验前面的细胞周期检测结果一致。本研究证实姜黄素对鼻咽癌CNE-2R细胞有放射增敏作用，其机制是通过调控p53通路中改变细胞周期及DNA损伤修复相关的基因表达。
目前, 国内的抗拒株的诱导方法[10-11]主要是用X射线低剂量(3 Gy以下)高剂量率间歇性照射诱导多次后，再高剂量(10 Gy以下)高剂量率间歇性照射诱导少次，总剂量在50 Gy以下。本文照射方法的特点：第一是将单次剂量增加至20 Gy，总剂量增加至100 Gy以上。根据相关规定，高剂量率大于12 Gy·h-1，中剂量率为2~12 Gy·h-1，低剂量率为0.4~2 Gy·h-1。并且在0.1 Gy·h-1至10 Gy·min-1的范围内，随着剂量率的升高，同一剂量的细胞杀灭作用升高。第二，该文选用了高剂量率放射诱导之后，直接选用了10 Gy·min-1的超高剂量率。在不同周期的细胞对射线敏感度不同，G2/M期最敏感，G1/G0期相对敏感，S期最不敏感。第三，本文照射方法选择最敏感的G2/M期细胞，筛选出放射抗拒性最强的细胞。第四是通过长达12个月长时间的放射诱导，鼻咽癌放射抗拒株细胞CNE-2R获得了稳定的放射抗拒性，在培养传代2年以上仍保持抗拒性。故综合以上特点的照射方法，既保证了其放射抗拒性的强度，也保证了其放射抗拒性的稳定性。
( 致谢: 对南方医科大学中药药理教研室、中医分子生物学实验室以及南方医院放疗科的全体老师和工作人员的全力支持表示衷心的感谢。)
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