2. 中国医学科学院北京协和 医学院医学生物学研究所，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南 昆明 650118
2. Institute of Medical Biology, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Yunnan Key Laboratory of Major Infectious Diseases Vaccine Development, Kunming 650118, China
甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)是一种以精神依赖为主的新型合成毒品，是目前最为流行的新型合成毒品之一[1-2]。METH神经毒性大、精神依赖性强、复吸率高，常因共用注射器和不洁性行为造成艾滋病病毒感染、传播，造成滥用者身心严重损害，使滥用者逐渐形成暴力倾向，给社会治安带来严重的负面影响。目前，对于microRNAs(miRNAs)与可卡因、酒精、尼古丁及阿片类成瘾性物质的研究报道较多，而对miRNAs在METH成瘾中的调控作用相关研究则相对缺乏。本文对miRNAs在METH成瘾机制中的表达特征及调控作用进行综述，并将与METH成瘾相关的miRNAs分子以及各miRNAs分子在不同组织器官中的差异性表达部位进行归纳整理，为进一步研究miRNAs分子在METH成瘾中的作用及发现新的药物作用靶点提供参考。
1 miRNAs简介miRNAs是一类长度约为22个碱基，高度保守的非编码单链小分子RNA，是一种新型基因转录后调控分子，可与靶基因mRNA的3'非翻译区(UTR区)特异性结合，从而使mRNA降解或抑制mRNA的翻译。miRNAs能与靶基因之间形成反馈回路，如miR-212-CREB、miR-212-MeCP2和miR-124-REST，这种反馈回路能有效提高相关分子通路的作用，从而实现在基因组水平、转录组水平以及蛋白组水平相互交叉的分子调控作用。miRNAs通常在转录后水平发生调节作用，从而影响基因活性，调节细胞分化、增殖、凋亡和肿瘤发生等多种生物学过程，几乎存在于所有的真核细胞中。此外，miRNAs广泛分布于人体的多种组织和细胞中，目前，在人类基因组中发现的miRNAs有1 500多条。miRNAs作为突触的调节因子，对突触的可塑性、功能及形态修饰具有重要的作用，而且与学习和记忆等高级认知功能有关。
2 METH成瘾机制METH成瘾又称METH依赖，是一种脑功能性障碍，其本质是机体长期接触METH后，中枢神经系统在分子、细胞、神经环路功能和脑结构等层次发生的代偿性适应，涉及奖赏、动机、学习记忆和抉择等众多高级精神神经活动[2]。也涉及中枢神经系统的许多脑区和核团，其中，中脑-皮质-边缘多巴胺奖赏系统是导致METH依赖的关键部位[3]。METH通过促进突触囊泡释放多巴胺(dopamine, DA)和抑制突触间隙DA的重摄取而间接激活DA受体[4]，进而激活奖赏系统，产生奖赏效应或强化作用，从而产生精神依赖性。中脑边缘DA系统是奖赏系统的重要组成部分，当腹侧被盖区-伏隔核-前额叶皮质通路(VTA-NAc-PFC通路)被激活时，腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA)多巴胺神经元放电活动增强，同时抑制γ-氨基丁酸(gamma amino butyric acid, GABA)能神经元活性，GABA释放减少，伏隔核(nucleus accumbens, NAc)和前额叶皮质(prefrontal cortex, PFC)的DA释放增加，从而产生奖赏效应[5]。研究表明[6]，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受体(离子型Glu受体)拮抗剂能抑制METH诱发的条件性位置偏爱(conditioned place preference, CPP)、自身给药行为以及运动刺激效应和“刻板”行为。此外，GABA系统和5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine, 5-HT)系统也参与METH成瘾的调控。有学者发现[7]，上调5-HT2受体的mRNA表达、使用5-HT3受体激动剂和使用GABA受体拮抗剂均能阻止METH诱导的CPP的发生。而且METH还可对5-羟色胺转运体产生直接作用，引起5-HT在细胞内累积，使机体产生欣快感和兴奋感。
此外，METH还可以改变奖赏脑区相关miRNAs的表达水平，负调控相关基因的表达，调节神经元可塑性和神经递质的释放，形成成瘾记忆，并使成瘾记忆和动机系统发生异常神经联系，产生异常的和强迫性的觅药行为，进而出现METH成瘾。
3 miRNAs在METH成瘾中的作用 3.1 miRNAs介导的网络调控在METH成瘾中的作用METH能诱导miRNAs表达水平的变化，而成瘾相关脑区miRNAs表达的改变直接参与了对METH成瘾行为的调节，这种由miRNA介导的网络调控在METH成瘾的形成中具有重要的意义。Saba等[8]研究发现，METH长期作用于小鼠会引起小鼠的前额叶皮质层、伏隔核和海马等多个脑区中miR-181a的表达升高，其中在海马区的升高最为明显；并且在海马神经元中，激活DA信号诱发miR-181a表达的同时，还能激活D1受体及GluA1的合成，提示miR-181a在METH成瘾中具有重要作用。Lippi等[9]连续5 d给小鼠注射METH，发现小鼠的皮层下边缘前脑、海马等重要脑区中的miR-29a、miR-29b、miR-182、miR-183等miRNAs发生了差异性表达。刘海莉等[10]用♂ Wistar大鼠皮下注射METH建立精神分裂症模型，结果发现大鼠的大脑和睾丸内miR-132和miR-212表达强烈增加。也有学者[20]发现当METH浓度大于100 μmol·L-1时，小鼠体内T细胞内抗HIV-1 microRNAs，如miR-125b、miR-150、miR-28-5p等的表达明显上调。据报道[9]，miR-x6等11个差异表达的miRNAs及其靶分子与METH成瘾及其神经毒性有关；其中，miR-x18的差异表达与习惯化行为的建立及药物成瘾核心特征强迫性用药行为的形成有关，并且在METH成瘾机制中具有一定的作用。
3.2 miRNAs调节神经递质释放，激活奖赏系统miRNAs大量存在于中枢神经系统，并对中枢神经系统具有重要的调控作用。研究发现[10]，miR-133b是位于1号染色体上新发现的miRNA分子，在中脑多巴胺能神经元上有丰富的表达，可以调节酪氨酸羟化酶和DAT的产生，而增加胞质中单胺类递质的水平，最终扰乱了DA浓度梯度，促使神经元释放DA，导致DA在突触间隙大量积累，进而激活奖赏系统，产生奖赏效应，从而产生精神依赖性。此外，人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)和METH可引起miR-9表达升高，进而引起多巴胺能神经元递质的释放，最终产生METH依赖。
3.3 miRNAs调节突触功能，增加奖赏通路的敏感性miRNAs还可以通过调节突触功能参与METH的成瘾过程。位于突触结构中的α-氨基轻甲基恶哇丙酸型谷氨酸(α-amino acid methyl propionate, AMPA)受体的动态表达被认为是突触可塑性改变的标志之一。研究表明[12]，AMPA受体在METH成瘾中发挥重要作用，miRNAs通过对AMPA受体的靶向调控而成为影响METH成瘾的重要分子。miR-181a能够在转录后水平下调AMPA受体中谷氨酸受体2亚型(glutamate receptor 2 subtype, GluA2) 的表达、限制树突棘的形成和降低海马神经元中兴奋性突触后电流，进而调控突触功能。另有研究发现[10]，miR504通过调控多巴胺神经元回路来调节突触功能；而miR96则通过抑制5-羟色胺1B及5-羟色胺3E受体的转录，进而起到调节神经元可塑性的作用。miR132通过调节环单磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic AMP response element binding protein, CREB)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)介导的信号通路，促进新生神经元树突成熟的过程。miR134则通过调节突触传递，降低人单丝氨酸蛋白激酶1基因的表达，从而减少树突棘的大小，但这并不影响树突棘的数目。miR143则可以直接调控神经干细胞的分化、发育和神经元可塑性。miR29a和miR-29b通过靶向肌动蛋白相关蛋白复合物亚单位3(actin related protein complex subunit 3, Arpc3) 调节树突棘形态，重塑肌动蛋白细胞骨架，影响突触形成，增加奖赏通路的敏感性，改变神经元可塑性，最终导致METH依赖的形成。
3.4 检测循环miRNAs的差异表达诊断METH成瘾循环miRNAs作为候选生物标志物，在疾病的早期诊断、药物治疗及预后判断中具有重要的作用。目前，己有循环miRNAs在阿尔茨海默病、多发性硬化症、双向情感障碍和精神分裂症等神经精神疾病中的研究报道[13-14]。而且循环miRNAs作为在血浆等体液中稳定存在的一种miRNAs，能够随着生理状况、疾病的类型和病程的不同而发生变化，形象地反映出人体生理学和病理学的改变。血浆中的循环miRNAs具有特异性、稳定性、标本易获得和易检测的特点，因此，可以将循环miRNAs的差异表达作为一种全新的无创生物标志物用于METH成瘾的诊断和治疗效果的判断依据。
综上所述，miRNAs及其靶基因在METH成瘾中起着重要调控作用。在METH的作用下，miRNAs的表达发生上调或下调，其调控的靶基因表达相应发生变化；同时靶基因的表达变化又反过来调控miRNAs，提高或降低调控回路的功能，进而改变下游基因表达，从而在神经系统中形成稳定、复杂的调控网络，影响METH成瘾的形成。因此，miRNAs作为“中介分子”在METH成瘾中起着重要的调控作用。
4 与METH成瘾密切相关的miRNAs分子METH可以通过增加伏隔核中的DA来增强其特性，伏隔核中的神经元有2个亚型，根据基因的差异表达分为多巴胺D1受体和D2受体。Miyamoto等[15]在敲除D2受体的小鼠伏隔核中显微注射腺病毒载体和METH，观察小鼠行为的改变以及小鼠伏隔核中D2受体的miRNA序列在METH诱导的信号转导中的变化，发现腺病毒载体使得小鼠伏隔核中D2受体的miRNA序列减少，但D1受体无变化。因此认为小鼠伏隔核中腺病毒包含D2受体的miRNA序列，而且D2受体介导的神经通路对伏隔核中的DA起抑制作用。有学者[16]通过大鼠的METH自身给药，并对大鼠前额皮质层进行miRNA芯片检测，最终确定了在大鼠前额皮层中METH诱导差异性表达的几个microRNA，具体包括miR-186、miR-195、miR-329、miR-127、miR-222、miR-24和miR-139。Bosch等[17]对SD大鼠实行14 d的禁欲和METH给药，每天在给METH后进行2 h的自我适应，最后对SD大鼠腹侧被盖区提取的RNA进行微阵列分析。最终确定了78个miRNA在中脑腹侧被盖区具有差异性表达，主要有：miR-9、miR-16、miR-20a、miR-23a、miR-23b、miR-26a、miR-27a、miR-27b、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-106b、miR-124、miR-125a-5p、miR-125b-5p、miR-128、miR-129、miR-140、miR-143、miR-145、miR-181a、miR-181d、miR-194、miR-195、miR-206、miR-212、miR-221、miR-222、miR-351、miR-383、miR-let-7d、miR-let-7e、Foxa1、DAT和Ret。还有学者[18]对124例METH滥用者的血浆中miRNA的差异性表达进行了研究，基于基因芯片筛选和实时RT-PCR定量方法对miRNAs的表达进行了测定。结果发现有14种miRNAs的表达发生了下调，其中有6种miRNAs(miR-181a、miR-181b、miR-221、miR-15b、miR-let-7e、miR-let-7d)在血浆中的表达均较正常对照组明显降低，而且miRNA表达的改变程度与过去几个月的药物使用频率呈负相关[19]。证明了血浆中miR-181a、miR-181b、miR-221、miR-15b、miR-let-7e、miR-let-7d在METH依赖的病理中发挥潜在的作用，并且上述miRNA可以作为一个潜在的周围的生物标志物用于METH依赖的诊断。此外，当METH给药小于15 d时，miR-181a和miR-15b的表达明显降低；当METH给药大于15 d时，miR-221、miR-let-7e和miR-let-7d的表达明显降低；miR-181b与METH给药天数关系不大。Tatro等[20]使用一种基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的阵列筛选技术对HIV阳性的METH滥用者的额叶皮层中的380个miRNAs的差异性表达进行检测，结果发现miR-9的表达量较正常人明显增加。研究结果表明，HIV-1在人类原始CD4+T细胞中的复制与METH存在剂量依赖性。当METH浓度为1~50 pmol·L-1时，METH对HIV-1复制的影响最小；当METH浓度大于100 pmol·L-1时，它以剂量依赖的方式抑制HIV-1病毒的复制。而且METH能够上调CD4+T细胞中抗HIV-1 miRNAs(miR-125b、miR-150、miR-28-5p)的表达，从而抑制HIV-1的复制。但miR-296-5p在CD4+T细胞中的表达并不受METH的调控，而且无法在SupT1细胞中扩增miR-223。
综上所述，随着对miRNAs以及METH成瘾机制研究的不断推进，miRNAs在METH成瘾中的作用逐渐明了，与METH成瘾密切相关的miRNAs分子也发现了很多。现将目前已经研究证实并报道的与METH成瘾相关的miRNAs分子进行汇总，见Tab 1，同时将各miRNAs分子在不同组织器官中的差异性表达部位列举如下，见Tab 2，以供同行参考。
| The different organism with the miRNAs molecules associated with methamphetamine addiction | miRNAs molecules associated with methamphetamine addiction |
| The miRNAs molecules associated with methamphetamine addiction in rats | miR-9, miR16, miR-20a, miR-23a, miR-23b, miR-24, miR-26a, miR-27a, miR-27b, miR-29a, miR-29b, miR-29c, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-106b, miR124, miR125a5p, miR-125b-5p, miR-127, miR-128, miR-129, miR-132, miR-139, miR-140, miR-143, miR145, miR181a, miR181d, miR-194, miR195, miR-206, miR-212, miR-221, miR-222, miR-329, miR-351, miR-383, miR-let-7d, miR-let-7e, Foxa1, DAT and Ret |
| The miRNAs molecules associated with methamphetamine addiction in mice | miR-x6, miR-x18, miR-28-5p, miR-29a, miR-29b, miR-125b, miR-150, miR-182 and miR-183 |
| The miRNAs molecules associated with methamphetamine addiction in human body | miR-9, miR-15b, miR-28-5p, miR-96, miR-125b, miR-133b, miR-134, miR-143, miR-150, miR-132, miR-181a, miR-181b, miR-221, miR-504, miR-let-7e and miR-let-7d |
| Site of differential expression of miRNAs molecule | Differentially expressed miRNAs molecules |
| The midbrain ventral tegmental area in SD rats | miR-9, miR16, miR-20a, miR-23a, miR-23b, miR-26a, miR-27a, miR-27b, miR-29a, miR-29b, miR-29c, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-106b, miR124, miR125a5p, miR-125b-5p, miR-128, miR-129, miR-140, miR-143, miR145, miR181a, miR181d, miR-194, miR195, miR-206, miR-212, miR-221, miR-222, miR-351, miR-383, miR-let-7d, miR-let-7e, Foxa1, DAT and Ret |
| The testis of SD rats | miR-132, miR-212 |
| The prefrontal cortex area in SD rats | miR-186, miR-195, miR-329, miR-127, miR-222, miR-24 and miR-139 |
| Most brain regions of mice | miR-29a, miR-29b, miR-182 and miR-183 |
| Mouse T cells | miR-125b, miR-150 and miR-28-5p |
| The mesencephalic dopaminergic neurons inhuman body | miR-96, miR-132, miR-133b, miR-134, miR-143, miR-181a, miR-504 |
| The human blood plasma | miR-181a, miR-181b, miR-221, miR-15b, miR-let-7e and miR-let-7d |
| The prefrontal cortex area in human body | miR-9 |
| Human CD4+T cells | miR-125b, miR-150 and miR-28-5p |
众多研究表明，METH能诱导miRNAs表达调控水平的改变，而且这种改变参与了对成瘾行为的调节。虽然，目前已经发现了很多参与METH成瘾调节的miRNAs分子，但miRNAs在METH成瘾机制中的作用及功能还尚不清楚。综合运用计算机分析、功能影像技术、神经生物学、生物信息学和分子生物学等多学科的技术方法，来研究miRNAs在METH成瘾中的作用及功能，阐明miRNAs的表达特征及调控功能，为研究成瘾机制提供新的可供参考的生物信息，同时也为发现新的药物作用靶点，建立新的防治策略提供科学依据。
| [1] | 林申, 满田囡, 李洪亮, 等. 甲基苯丙胺定性分析方法的研究进展[J]. 中国药物滥用防治杂志, 2016, 22(1): 58-62. Lin S, Man T N, Li H L, et al. Research progress on qualitative analysis methods of methamphetamine[J]. Chin J Drug Abuse Prev Treat, 2016, 22(1): 58-62. |
| [2] | 陈绮, 梁军成, 邓艳萍. 药物成瘾与表观遗传学[J]. 中国药物依赖性杂志, 2015, 24(1): 1-5. Chen Q, Liang J C, Deng Y P. Drug addiction and epigenetic[J]. Chin J Drug Depend, 2015, 24(1): 1-5. |
| [3] | 张盼盼, 徐文锦, 刘惠芬. 中枢神经系统ERK信号通路在药物成瘾中的作用机制研究进展[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(1): 1-9. Zhang P P, Xu W J, Liu H F. Research progress on mechanism of ERK signaling pathway in drug addiction[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(1): 1-9. |
| [4] | 杨黎华, 白洁. 单胺类神经递质在药物成瘾中的作用机制[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(2): 149-52. Yang L H, Bai J. Roles of monoamine neurotransmitters in the mechanism of drug addiction[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(2): 149-52. |
| [5] | 江明金, 李婵, 林莹波, 等. miRNAs在苯丙胺类兴奋剂成瘾中作用的研究进展[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(10): 1352-5. Jiang M J, Li C, Lin Y B, et al. Research progress on the role of miRNAs in amphetaminetype stimulants addiction[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(10): 1352-5. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.10.006 |
| [6] | 郝柳, 罗涛, 唐爱国, 等. 甲基苯丙胺滥用的研究进展[J]. 中国药物滥用防治杂志, 2015, 21(5): 302-6. Hao L, Luo T, Tang A G, et al. The research progress of methamphetamine abuse[J]. Chin J Drug Abuse Prev Treat, 2015, 21(5): 302-6. |
| [7] | Stoops W W, Bennett J A, Lile J A, et al. Influence of aripiprazole pretreatment on the reinforcing effects of methamphetamine in humans[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2013, 47: 111-7. doi:10.1016/j.pnpbp.2013.08.007 |
| [8] | Saba R, Storchel P H, Aksoy-Aksel A, et al. Dopamine-regulated microRNA miR-181a controls G1uA2 surface expression in hippocampal neurons[J]. Mol Cell Biol, 2012, 32(3): 619-32. doi:10.1128/MCB.05896-11 |
| [9] | Lippi G, Steinert J R, Marczylo E L, et al. Targeting of the Arpc3 actin nucleation factor by miR-29a/b regulates dendritic spine morphology[J]. J Cell Biol, 2011, 194(6): 889-904. doi:10.1083/jcb.201103006 |
| [10] | 刘海莉, 朱德晓, 吴金涛. 细胞外信号调节激酶/miR-133b在甲基苯丙胺致PC12细胞神经毒性的作用及机制[J]. 解剖学报, 2014, 45(6): 755-60. Liu H L, Zhu D X, Wu J T, et al. Role and mechanism of extracellular signal-regulated kinase/miR-133b pathway in methamphetamine-induced neurotoxicity in PC12 cells[J]. Acta Anat Sin, 2014, 45(6): 755-60. |
| [11] | Mantri C K, Mantri J V, Dash C, et al. Methamphetamine inhibits HIV-1 replication in CD4+ T cells by modulating anti-HIV-1 miRNA expression[J]. Am J Pathol, 2014, 184(1): 92-100. doi:10.1016/j.ajpath.2013.09.011 |
| [12] | 王子云, 刘志民. 甲基苯丙胺成瘾者成瘾行为特征定性研究[J]. 中国药物依赖性杂志, 2015, 24(1): 60-5. Wang Z Y, Liu Z M. Characteristics of addiction behaviors among methamphetamine dependent users:a qualitative research[J]. Chin J Drug Depend, 2015, 24(1): 60-5. |
| [13] | de Mena L, Coto E, Cardo L F, et al. Analysis of the micro-RNA-133 and PITX3 genes in Parkinson′s disease[J]. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet, 2010, 153B(6): 1234-9. |
| [14] | Xu Y, Zhang X, Pu S, et al. Circulating microRNA expression profile: a novel potential predictor for chronic nervous lesions[J]. Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai), 2014, 46(11): 942-9. |
| [15] | Miyamoto Y, Iida A, Sato K, et al. Knockdown of dopamine D2 receptors in the nucleus accumbens core suppresses methamphetamine-induced behaviors and signal transduction in mice[J]. Int J Neuropsychopharmacol, 2015, 18(4): 1-7. |
| [16] | Du H Y, Cao D N, Chen Y, et al. Alterations of prefrontal cortical microRNAs in methamphetamine selfadministering rats:from controlled drug intake to escalated drug intake[J]. Neurosci Lett, 2016, 6(11): 21-7. |
| [17] | Bosch P J, Benton M C, Macartney-Coxson D, et al. mRNA and microRNA analysis reveals modulation of biochemical pathways related to addiction in the ventral tegmental area of methamphetamine self-administering rats[J]. BMC Neurosci, 2015, 16: 43. doi:10.1186/s12868-015-0186-y |
| [18] | Zhao Y, Zhang K, Jiang H, et al. Decreased expression of plasma microRNA in patients with methamphetamine(MA) use disorder[J]. J Neuroimmune Pharmacol, 2016, 11(3): 542-8. doi:10.1007/s11481-016-9671-z |
| [19] | Chandrasekar V, Dreyer J L. Regulation of miR-124, Let-7d and miR-181a in the accumbens affects the expression, extinction, and reinstatement of cocaine-induced conditioned place preference[J]. Neuropsychopharmacology, 2011, 36(6): 1149-64. doi:10.1038/npp.2010.250 |
| [20] | Tatro E T, Hefler S, Shumaker-Armstrong S, et al. Modulation of BK channel by microRNA-9 in neurons after exposure to HIV and methamphetamine[J]. J Neuroimmune Pharmacol, 2013, 8(5): 1210-23. doi:10.1007/s11481-013-9446-8 |