2. 河北大学 医学院，河北 保定 071000
2. Basic Medical College, Hebei University, Baoding Hebei 071000, China
血栓由血管内局部血液凝固引起。血栓形成可阻塞供血血管，从而引发心绞痛、心肌梗死、短暂性脑缺血发作、脑卒中、外周动脉缺血等疾病。目前以血栓形成为病理特征的心脑血管疾病已经成为当今世界最主要的致死原因，危害极大[1]。组织因子(tissue factor, TF)是启动凝血的关键因子，在血栓形成过程中发挥极为重要的作用。TF是一个由263个氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白, 分子质量约为47 ku，主要由内皮细胞表达，也可表达于血管平滑肌、单核巨噬细胞等处。正常情况下TF不存在于循环中或不与循环血液接触，炎症、高脂血症及氧化应激时可诱导TF表达，进而启动血液凝固级联反应，促进血栓形成[2]。
芒果苷(mangiferin，Mang)属双苯吡酮类化合物，是芒果叶的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎症的作用[3]，但是其对TF表达的调节作用尚未见报道。因此，本研究利用PCR、Western blot等技术检测了芒果苷对TF表达及活性的影响，并初步探讨了其中的机制，以期为相关疾病的治疗提供新思路与新靶点。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器芒果苷纯度≥98%，购自河北博奥生物科技有限公司。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, oxLDL)、小鼠抗人β-actin单克隆抗体及小鼠抗人TF单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，HRP标记羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，PCR引物(北京博迈德科技发展有限公司)，RNA TRIzol(美国Invitrogen生命技术公司)，反转录试剂盒(MBI Fermentas公司)，TF活性检测试剂盒(美国Invitrogen生命技术公司)，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)转录活性检测试剂盒(美国Abcam公司)。细胞培养箱(赛默飞世尔科技公司), 倒置显微镜(日本Nikon公司), 实时定量PCR仪(赛默飞世尔科技公司)，多功能电泳仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的培养从人脐静脉中分离原代内皮细胞，种植于铺有鼠尾胶原的培养皿中，用含10%胎牛血清的M199培养基常规培养。细胞传至第3代后以倒置显微镜观察，细胞呈梭形或多角形，铺路石状排列。当细胞生长至融合时加入药物进行刺激。
1.2.2 荧光实时定量PCR检测TF mRNA的表达药物刺激后，收集细胞，利用TRIzol法提取细胞总RNA，并反转录为cDNA。用MxPro QPCR系统进行定量PCR检测。β-actin作为内参照。PCR反应使用的特异寡聚核苷酸引物均为自行设计，由北京奥科生物技术公司合成。域值、Ct值由MxPro QPCR系统自动计算。所涉及引物如下：人组织因子途径抑制物(hTF)：正义链为5′-TCCCTCCCGAACAGTTAACC-3′，反义链为5′-CCCACTCCTGCCTTTCTACA-3′；β-肌动蛋白(β-actin)：正义链为5′-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3′，反义链为5′-CGTACAGGTCTTTGCGGATG-3′。
1.2.3 Western blot方法检测蛋白表达收集细胞，提取蛋白质，进行SDS-PAGE电泳, 转膜封闭后，加入适当浓度的第一抗体(室温孵育4h)和第二抗体(室温孵育1h)后，进行化学发光(ECL)显色，以β-actin作为内参照，观察TF蛋白的表达情况，并以NIH Image J软件对条带灰度进行分析。
1.2.4 二步法测定TF抗凝活性将细胞裂解液与氯化钙溶液、饱和的FVII混合。孵育2 h后加入高浓度FX与Chromozym X，再检测405 nm处的吸光度。具体步骤按试剂盒说明操作。
1.2.5 PPARγ转录活性测定裂解血管内皮细胞后，按试剂盒操作说明提取核蛋白。96孔板板底已预先铺好含有PPRE的双链DNA，每孔加入100 μg核蛋白提取物。再依次加入PPARγ一抗、辣根过氧化酶标记的二抗。洗板后再检测450 nm处的吸光度。具体步骤按试剂盒说明操作。
1.2.6 统计学处理数据以x±s表示，用SPSS12.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析及q检验。P＜0.05为有统计学意义。
2 结果 2.1 芒果苷剂量依赖性抑制内皮细胞TF表达以oxLDL(10 mg·L-1)刺激HUVECs，6 h后收集样品，利用实时定量PCR与Western blot法分别检测TF mRNA与蛋白质的表达水平。Fig 1结果表明，oxLDL明显上调内皮细胞TF mRNA与蛋白表达(P＜0.01)。为观察芒果苷的治疗作用，在oxLDL刺激内皮细胞的同时，分别给予0.1、0.5、1 mmol·L-1的芒果苷。结果表明，0.1 mmol·L-1的芒果苷对TF的表达无明显调节作用，而0.5、1 mmol·L-1的芒果苷均明显逆转oxLDL对TF mRNA的上调作用(Fig 1A，P＜0.05)，但是与oxLDL刺激组比较，TF蛋白只被1 mmol·L-1芒果苷明显下调(Fig 1B，P＜0.05)。这些结果提示，芒果苷可以剂量依赖性抑制TF的表达。
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| Fig 1 Mangiferin suppresses endothelial TF expression at mRNA(A) and protein(B) levels in a dose-dependent manner(x±s, n=3) **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs oxLDL |
分别给予人脐静脉内皮细胞oxLDL(10 mg·L-1)、ox-LDL(10 mg·L-1)加芒果苷(0.1、0.5、1 mmol·L-1)，6 h后收集培养上清，利用发色底物法检测TF的活性。Fig 2结果表明，oxLDL明显增强TF活性(P＜0.01)。与oxLDL刺激组比较，1 mmol·L-1芒果苷明显抑制TF的活性(P＜0.05)，而0.1、0.5 mmol·L-1芒果苷不能明显逆转oxLDL对TF活性的促进作用。
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| Fig 2 Mangiferin inhibits the pro-coagulant activities of endothelial TF in a dose-dependent manner **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs oxLDL |
以oxLDL(10 mg·L-1)刺激HUVECs，同时给予芒果苷(1 mmol·L-1)或芒果苷(1 mmol·L-1)加上PPARγ抑制剂——GW9662 (10 μmol·L-1)处理细胞，细胞6h后检测TF表达。Fig 3结果表明，oxLDL诱导TFmRNA及蛋白表达。与oxLDL刺激组比较，oxLDL加芒果苷组使TF表达明显下调，而GW9662明显阻断了芒果苷对TF表达的抑制作用。
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| Fig 3 GW9662 abolishes suppressive effect of mangiferin on TF mRNA(A) and protein(B) expression(x±s, n=3) **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs oxLDL |
以oxLDL(10 mg·L-1)刺激HUVECs，同时给予芒果苷(1 mmol·L-1)或芒果苷(1 mmol·L-1)加上PPARγ抑制剂——GW9662 (10 μmol·L-1)处理细胞，细胞6h后检测TF活性。Fig 4结果表明，oxLDL增强TF促凝血活性。与oxLDL刺激组比较，oxLDL加芒果苷组使TF活性明显下调，而GW9662明显阻断了芒果苷对TF的抑制作用。
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| Fig 4 GW9662 abolishes suppressive effect of mangiferin on TF pro-thrombotic activity(x±s, n=3) **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs oxLDL |
分别以芒果苷(0.1、0.5、1 mmol·L-1)处理HUVECs，6 h后收集样品，利用相关试剂盒检测PPARγ活性水平。结果表明，0.5、1 mmol·L-1芒果苷明显增强了PPARγ的活性(Fig 5A)。然后，分别给予以oxLDL(10 mg·L-1)、oxLDL(10 mg·L-1)加芒果苷(1 mmol·L-1)、oxLDL(10 mg·L-1)加芒果苷(1 mmol·L-1)再加GW9662(10μmol·L-1)处理HUVECs，6 h后收集样品，检测PPARγ活性。结果表明，与对照组相比，oxLDL对PPARγ活性有微小的上调作用，但差异无统计学意义(Fig 5B)。芒果苷(1 mmol·L-1)处理后明显增强了PPARγ的活性，但其作用可被GW9662所逆转。
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| Fig 5 Mangiferin enhances PPARγ activity in vascular endothelial cells A:PPARγ activity was enhanced by mangiferin at the indicated doses; B:GW9662 abolished the effect of mangiferin on PPARγ; *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs oxLDL+mangiferin |
TF可作为膜蛋白存在于细胞表面，也可以被释放至血浆中。细胞表面或循环中的TF通过与凝血因子Ⅶ/ Ⅶa结合，激活凝血因子X与IX，进而启动血液凝固级联反应，导致血栓形成[4]。TF表达于多种细胞，近年来不同细胞来源的TF在血栓形成中的作用被进一步深入探讨。Day等[5]利用TF基因敲除(TF-/-)小鼠或“低-TF”小鼠与野生型小鼠进行交叉骨髓移植。通过这一手段发现，血管壁来源的TF在大血管血栓形成中发挥主要作用。2009年，Chen等[6]利用TFflox/flox小鼠分别与Tie2-Cre小鼠或SM22-Cre小鼠杂交，使TF分别在内皮-血细胞或平滑肌细胞中被特异性敲除。利用激光损伤模型观察到内皮细胞与血细胞敲除TF后血栓形成明显减少，平滑肌细胞特异性敲除对血栓影响不大。综上所述，血管内皮来源的TF在血栓形成中发挥重要作用，而本研究检测了oxLDL及芒果苷等对血管内皮细胞中TF表达的影响。
高脂血症等原因可加速血栓形成，进而引发心脑血管疾病[7]。oxLDL是诱发心血管病重要危险因子，其水平在高脂血症患者体内明显升高。Owens等[8]报道，oxLDL通过上调TF加速血栓形成。本研究结果也表明，oxLDL可上调血管内皮细胞TF的表达，并增强其促凝血活性。
芒果苷具有多种生物活性，Das等[9]研究表明，芒果苷可以缓解D-半乳糖胺诱导的肝组织氧化应激。还有研究证实芒果苷具有明显的抗炎作用[3]。尽管炎症及氧化应激与TF关系密切[4]，但是芒果苷对TF表达的影响尚未见报道。本研究表明，芒果苷剂量依赖性方式抑制血管内皮细胞中TF表达，同时高剂量的芒果苷还能明显抑制TF促凝血活性。
PPARγ属于核受体超家族，当其与相应配体结合后激活，可作为转录因子进入细胞核，调节靶基因转录。PPARγ的合成型激动剂罗格列酮与天然激动剂15去氧前列腺素J2均可以抑制TF表达[10-11]。Eligini等[10]证实，PPARγ激活后可以抑制NF-κB/I-κB与MAPK途径，而这两条信号转导途径最终诱导TF表达。但是，以往研究并未报道芒果苷对PPARγ途径的影响。本研究则证实，芒果苷可增强PPARγ转录活性，而PPARγ特异性抑制剂GW9662则阻断了芒果苷对TF表达及活性的抑制作用。这些结果提示，芒果苷下调TF的作用是由PPARγ介导的。但是本研究尚无法证实芒果苷是否为PPARγ的特异性配体，因此还需进一步深入研究。
综上所述，心血管危险因子——oxLDL诱导血管内皮细胞中TF的表达，而芒果苷通过激活PPARγ，进而阻断了oxLDL对TF的诱导作用。TF在血栓形成中发挥关键作用，因此本研究可能为干预血栓相关疾病提供新思路与新靶点。
| [1] | Viles-Gonzalez J F, Fuster V, Badimon J J. Atherothrombosis: a widespread disease with unpredictable and life-threatening consequences[J]. Eur Heart J, 2004, 25(14): 1197-207. doi:10.1016/j.ehj.2004.03.011 |
| [2] | Cimmino G, D′Amico C, Vaccaro V, et al. The missing link between atherosclerosis, inflammation and thrombosis: is it tissue factor[J]. Expert Rev Cardiovasc Ther, 2011, 9(4): 517-23. doi:10.1586/erc.11.40 |
| [3] | 王阳阳, 于惠玲, 李田阳, 等. HO-1介导芒果苷对大鼠肝脏缺血/再灌注损伤的保护作用[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(5): 736-7. Wang Y Y, Yu H L, Li T Y, et al. Protective effect of HO-1 mediated mangiferin on liver ischemia/reperfusion injury in rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(5): 736-7. |
| [4] | 邓华菲, 任重, 唐伟军, 等. 外源性硫化氢抑制ox-LDL诱导血管内皮细胞组织因子的表达与降低ROS产生和抑制NF-κB活化有关[J]. 中国药理学通报, 2014, 30(7): 979-84. Deng H F, Ren Z, Tang W J, et al. Exogenous hydrogen sulfide inhibits expression of tissue factor induced by ox-LDL through reducing generation of ROS and inhibiting NF-κB activation in endothelial cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2014, 30(7): 979-84. |
| [5] | Day S M, Reeve J L, Pedersen B, et al. Macrovascular thrombosis is driven by tissue factor derived primarily from the blood vessel wall[J]. Blood, 2005, 105(1): 192-8. doi:10.1182/blood-2004-06-2225 |
| [6] | Chen V, Merrill-Skoloff G, Wang L, et al. Intravascular but not extravascular tissue factor is required for fibrin generation during thrombus formation in cremaster arterioles in living mice subjected to laser injury[J]. ASH Annual, 2009, 114(22): 332. |
| [7] | Dentali F, Squizzato A, Ageno W. The metabolic syndrome as a risk factor for venous and arterial thrombosis[J]. Semin Thromb Hemost, 2009, 35(5): 451-7. doi:10.1055/s-0029-1234140 |
| [8] | Owens A P 3rd, Passam F H, Antoniak S, et al. Monocyte tissue factor-dependent activation of coagulation in hypercholesterolemic mice and monkeys is inhibited by simvastatin[J]. J Clin Invest, 2012, 122(2): 558-68. doi:10.1172/JCI58969 |
| [9] | Das J, Ghosh J, Roy A, et al. Mangiferin exerts hepatoprotective activity against D-galactosamine induced acute toxicity and oxidative/nitrosative stress via Nrf2-NF-κB pathways[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2012, 260(1): 35-47. doi:10.1016/j.taap.2012.01.015 |
| [10] | 严国强, 陈春香, 陈芳辉, 等. PPARγ介导卡托普利改善高糖诱导血管内皮细胞胰岛素抵抗的作用[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(4): 532-737. Yan G Q, Chen C X, Chen F H, et al. Improvement effect of captopril on insulin resistance mediated by PPARγin vascular endothelial cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(4): 532-737. |
| [11] | Park J B, Kim B K, Kwon Y W, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists suppress tissue factor overexpression in rat balloon injury model with paclitaxel infusion[J]. PLoS One, 2011, 6(11): e28327. doi:10.1371/journal.pone.0028327 |