黑鱼(Channa argus)为鳢科鳢种Channidae动物，在《本草纲目》中记载“黑鱼鱼胆气味：甘，平，诸鱼胆苦，惟此胆甘可食为异也。”并提到具有治疗喉痹的作用。现代研究未见关于黑鱼鱼胆的药效和成分研究。本文通过小鼠脾细胞增殖实验和LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO活性实验追踪的方法从黑鱼胆汁中分离出化合物(C1) 牛黄胆酸钠和化合物(C2) 牛黄鹅去氧胆酸钠，并对其构效关系进行了初步探讨，以期为牛黄胆酸钠和牛黄鹅去氧胆酸钠的后续研究提供参考[1-5]。
1 仪器与材料旋转蒸发器RE-3000(上海亚荣生化仪器厂)，分析型高效液相色谱仪(岛津公司，型号：LC-2010A)，立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备)，XD-202荧光倒置生物显微镜(南京江南永新光学有限公司)，超净台(苏州净化设备有限公司)，烘箱(上海跃进医疗器械一厂)，色谱柱(北京绿百草科技发展有限公司)，超纯水制造仪(成都超纯科技有限公司)，CO2培养箱(美国Shellab公司)，电子天平(d=0.001 g，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，电子天平(d=0.01 mg，赛多利斯科学仪器有限公司)，移液枪(赛默飞世尔科技有限公司)。
硅胶(200~300目)(上海灵一工贸有限公司)，甲醇(南京化学试剂有限公司)，乙醇(南京化学试剂有限公司)，乙腈(ROE SCIENTIFIC INC公司)，乙酸乙酯(南京化学试剂有限公司)，氯仿(南京化学试剂有限公司)，正丁醇(南京化学试剂有限公司)，青霉素(美国Amresco公司)，链霉素(美国Amresco公司)，NH4Cl(南京化学试剂有限公司)，Na2HPO4·12H2O(南京化学试剂有限公司)，KH2PO4(南京化学试剂有限公司)，NaCl(南京化学试剂有限公司)，KCl(南京化学试剂有限公司)，Tris(南京化学试剂有限公司)，NaHCO3(南京化学试剂有限公司)，DMEM(美国Gibco公司)，胎牛血清(BI)，MTT(Biosharp)。
2 方法 2.1 提取与分离取黑鱼胆汁10 mL，加入等体积氯仿萃取3次、再加入乙酸乙酯萃取3次，最后用等体积正丁醇萃取3次，分别得到氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。将各相减压蒸干，分别得到样品粗提物127、34、206、23 mg。
将正丁醇萃取相粗提物进行硅胶柱(200~300目)分离，采用干法装柱和干法上样；用乙酸乙酯:甲醇=4 :1进行等度洗脱，并用薄层色谱进行跟踪检测；将相同样品进行合并、减压浓缩；减压蒸干后用少量甲醇进行溶解，取出溶液，在室温进行挥干；得到纯化样品C1(23 mg)和纯化样品C2(16 mg)，最后用氢谱、碳谱对两个样品进行结构确认[6-7]。
2.2 抗炎活性研究 2.2.1 小鼠脾淋巴细胞增殖实验和对正常脾淋巴细胞的毒性作用将小鼠眼眶放血致死，75%乙醇浸泡5~10 min，于超净工作台中取出脾脏并将脾脏至于无菌细胞筛上(200目)，研磨，收集研磨液离心(1 000 r·min-1，5 min)，用Tris-氯化铵溶液洗涤细胞3次，然后用培养基重悬；最后将细胞进行台盼蓝活细胞染色，存活率95%以上，调整活细胞浓度为2×106个每毫升，于96孔板每孔加入细胞100 μL；抑制脾淋巴细胞增殖实验组加入ConA与加入药物同时进行，毒性实验组只加入药物进行治疗，每组设置6个复孔，将96孔板在37 ℃，5% CO2培养箱中孵育48 h；向96孔板中加入5 g·L-1的MTT，每孔20 μL，于培养箱中继续培养4 h；弃去96孔板中的培养液，每孔加入100 μL DMSO，轻轻混匀，用酶标仪于测量波长570 nm，参比波长630 nm处测定吸光值[8]，根据吸光值计算相对活细胞数。
2.2.2 巨噬细胞释放NO实验和对巨噬细胞毒性作用将冻存的小鼠巨噬细胞RAW264.7从液氮罐中取出，放入37 ℃水浴复苏，800 r·min-1离心5 min，弃去上清液，混悬细胞，接种于细胞培养瓶中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取处于对数生长期的RAW264.7细胞进行收集、重悬调整细胞浓度为5×105个每毫升，于96孔板中每孔加入细胞100 μL，n=5，过夜，次日，抑制巨噬细胞释放NO组用LPS(2.5 mg·L-1)进行诱导，与此同时，给予药物进行治疗，毒性实验组只进行药物治疗，药物作用24 h后，收集细胞培养液，离心，取上清，用NO检测试剂A液(50 μL)、B液(50 μL)，常温静置反应10 min后酶标仪540 nm下检测OD值，根据标曲计算细胞上清液中的NO含量[9-10]，毒性实验组中向96孔板中加入5 g·L-1的MTT，每孔20 μL，于培养箱中继续培养4 h；弃去96孔板中的培养液，每孔加入100 μL DMSO，轻轻混匀，用酶标仪于测量波长570 nm，参比波长630 nm处测定吸光值[8]，计算相对活细胞数。
2.3 统计处理采用SPSS 19.0(SPSS Inc. Chicago，IL，USA)软件进行统计分析。结果以x±s表示。组间比较采用T检验。
3 结果 3.1 结构鉴定化合物(C1)：白色无定形粉末，1H-NMR(300 MHz，CD3OD)δ：3.95(1H，s，H-3)，3.79(1H，s，H-7)，3.35(1H，s，H-12)，3.60(2H，t，J=6.6 Hz，H-1′)，2.97(2H，t，J=6.6 Hz，H-2′)，0.71(3H，s，H-21)，0.91(3H，s，H-19)，1.08(3H，d，J=5.6 Hz，H-18)13C-NMR(300 MHz，CD3OD)δ：37.0(C-1)，31.7(C-2)，73.4(C-3)，41.0(C-4)，43.5(C-5)，36.4(C-6)，69.5(C-7)，41.5(C-8)，28.4(C-9)，36.4(C-10)，30.1(C-11)，74.5(C-12)，48.0(C-13)，43.7(C-14)，24.7(C-15)，29.2(C-16)，48.5(C-17)，18.5(C-18)，23.6(C-19)，37.4(C-20)，18.3(C-21)，34.7(C-22)，33.6(C-23)，177.5(C-24)，37.1(C-1′)，52.0(C-2′)，以上数据与文献报道基本一致[11]，故化合物(C1) 为牛黄胆酸钠(Fig 1：C1)。
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| Fig 1 Molecular structure of C1 and C2 C1: Sodium taurocholate; C2: Sodium taurochenodeoxycholate |
化合物(C2)：白色无定形粉末，1H-NMR(300 MHz，CD3OD)δ：3.79(1H，s，H-3)，3.35(1H，s，H-7)，3.60(2H，t，J=6.6 Hz，H-1′)，2.98(2H，t，J=6.6 Hz，H-2′)，0.69(3H，s，H-21)，0.92(3H，s，H-19)，0.98(3H，d，J=6.2 Hz，H-18)13C-NMR(300 MHz，CD3OD)δ：36.9(C-1)，31.9(C-2)，73.4(C-3)，41.3(C-4)，43.7(C-5)，36.4(C-6)，69.5(C-7)，41.6(C-8)，25.1(C-9)，36.7(C-10)，29.8(C-11)，41.0(C-12)，48.7(C-13)，44.2(C-14)，25.1(C-15)，29.8(C-16)，48.9(C-17)，12.7(C-18)，23.9(C-19)，37.1(C-20)，19.4(C-21)，34.7(C-22)，33.6(C-23)，177.5(C-24)，37.1(C-1′)，52.1(C-2′)，以上数据与文献报道基本一致[12]，故化合物(C2) 为牛黄鹅去氧胆酸钠(Fig 1：C2)。
3.2 抗炎活性 3.2.1 小鼠脾淋巴细胞增殖实验和对正常脾细胞的毒性作用在利用Con A诱导小鼠脾淋巴细胞增殖实验筛选黑鱼鱼胆的抗炎活性中，阳性药地塞米松、黑鱼鱼胆粗提物25、50、100 mg·L-1、氯仿萃取相(50 mg·L-1)、乙酸乙酯萃取相(50 mg·L-1)、正丁醇萃取相(50 mg·L-1)和水相(50 mg·L-1)细胞相对活力分别为52.5%±8.1%、86.7%±3.9%、73.2%±7.7%、60.0%±9.0%、95.7%±7.9%、90.4%±6.6%、64.0%±5.9%、99.4%±10.0%，其中阳性药地塞米松、黑鱼鱼胆粗提物50、100 mg·L-1、正丁醇萃取相与模型组(100.0%±7.9%)比较差异具有极显著性(P＜0.01)(Fig 2)；然后继续对正丁醇相进行分离纯化得到的化合物牛黄胆酸钠(C1) 和牛黄鹅去氧胆酸钠(C2) 进行小鼠脾淋巴细胞增殖实验和毒性实验，药物浓度50 mg·L-1的细胞相对活力分别为65.9%±11.7%、60.5%±9.3%(Fig 3，Fig 4)，与模型组(100.0%±9.8%、100.0%±3.7%)相比差异均具有极显著性(P＜0.01)；毒性实验结果显示除阳性药地塞米松组(细胞相对活力为：76.8%±5.1%，正常组细胞相对活力：100.0%±2.8%)有明显脾淋巴细胞毒性外，其余各个给药组与正常组比较差异无显著性，说明化合物C1和化合物C2能明显地抑制Con A诱导脾淋巴细胞产生的炎症反应，且对小鼠脾淋巴细胞无毒性作用(Fig 5)。
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| Fig 2 Spleen lymphocyte proliferation assay 1: Normal; 2: Model(ConA:5 mg·L-1); 3: Hexadecadrol(20 mg·L-1); 4:Crude Extracts(25 mg·L-1); 5:Crude Extracts(50 mg·L-1); 6:Crude Extracts(100 mg·L-1); 7:Chloroform extract phase(50 mg·L-1); 8:Ethyl acetate extract phase(50 mg·L-1); 9:Normal butanol extract phase(50 mg·L-1); 10:Water extract phase(50 mg·L-1); ##P < 0.01 vs 1(normal group); **P < 0.01 vs 2(model group) |
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| Fig 3 Spleen lymphocyte proliferation assay of C1 1: Normal; 2: Model(ConA: 5 mg·L-1); 3:Hexadecadrol(20 mg·L-1); 4:3.125 mg·L-1; 5:6.25 mg·L-1; 6:12.5 mg·L-1; 7:25 mg·L-1; 8:50 mg·L-1; ##P < 0.01 vs 1(normal group); **P < 0.01 vs 2(model group) |
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| Fig 4 Spleen lymphocyte proliferation assay of C2 1: Normal; 2: Model(ConA:5 mg·L-1); 3:Hexadecadrol(20 mg·L-1); 4:3.125 mg·L-1; 5:6.25 mg·L-1; 6:12.5 mg·L-1; 7:25 mg·L-1; 8:50 mg·L-1; ##P < 0.01 vs 1(normal group); *P < 0.05, **P < 0.01 vs G2(model group) |
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| Fig 5 Cytotoxic effect of C1 and C2 on spleen lymphocytes 1: Normal; 2: Hexadecadrol(20 mg·L-1); 3: C1 (12.5 mg·L-1); 4: C1(25 mg·L-1); 5:C1(50 mg·L-1); 6:C2(12.5 mg·L-1); 7:C2(25 mg·L-1); 8:C2(50 mg·L-1). **P < 0.01 vs normal group |
在利用LPS诱导巨噬细胞RAW264.7释放NO实验中阳性药双氯芬酸钠、化合物C1(50 mg·L-1)和化合物C2(50 mg·L-1) NO释放量分别为(4.0±2.2)、(16.4±1.9)、(15.5±1.7) μmol·L-1和模型组(30.7±2.8) μmol·L-1相比差异均具有极显著性(P＜0.01)(Fig 6)，巨噬细胞毒性实验结果显示各个给药组与空白组比较差异无显著性，说明化合物C1和化合物C2能极显著地抑制LPS诱导巨噬细胞产生的炎症反应，且对巨噬细胞无毒性作用(Fig 7)。
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| Fig 6 LPS-induced mouse macrophage RAW264.7 releasing NO 1: Normal; 2: Model(LPS:2.5 mg·L-1); 3: Diclofenac sodium(25 mg·L-1); 4: C1(12.5 mg·L-1); 5: C1(25 mg·L-1); 6: C1(50 mg·L-1); 7: C2(12.5 mg·L-1); 8: C2(25 mg·L-1); 9: C2(50 mg·L-1). ##P < 0.01 vs 1(normal group); **P < 0.01 vs 2(model group) |
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| Fig 7 Cytotoxic effect of C1 and C2 on macrophage 1: Normal; 2: Diclofenac sodium(25 mg·L-1); 3: C1(12.5 mg·L-1); 4: C1(25 mg·L-1); 5: C1(50 mg·L-1); 6: C2(12.5 mg·L-1); 7: C2(25 mg·L-1); 8: C2(50 mg·L-1) |
牛黄胆酸钠在牛、羊、蛇等动物胆汁中都有被发现，而在鱼类中只有在太阳鱼、鲟鱼中有含牛黄胆酸钠的相关报道。牛黄鹅去氧胆酸钠在鸡、蛇等动物胆汁中有相关报道，在鱼类中未见含牛黄鹅去氧胆酸钠的相关报道。目前，关于牛黄胆酸钠和牛黄鹅去氧胆酸钠的药理活性的研究有抗炎、镇咳、祛痰等作用，未见关于从细胞水平的抗炎活性和毒性研究。
脾脏作为机体最大的免疫器官含有60%的B淋巴细胞和40%的T淋巴细胞，当抗原和异物进入脾脏后发生免疫识别、免疫应答、免疫效应，从而释放炎症因子，正常情况下，这些细胞因子可以帮助机体消灭异物，而大量的细胞因子的产生则会引起炎症反应[13]。Con A能非特异性的刺激淋巴细胞发生增殖，产生过量的炎症因子。因此，通过Con A刺激脾淋巴细胞增殖实验，可以用以抗炎药物的活性筛选。机体清道夫——巨噬细胞，能吞噬机体内坏死细胞、病原体等多种异物，同时也参与机体免疫防御、免疫监视、免疫调节等多个阶段，在免疫和炎症方面发挥着举足轻重的作用；脂多糖作为细菌内毒素能刺激巨噬细胞产生大量的IL-1、IL-6、NO等炎症介质，从而引起机体炎症反应[14-15]。
本研究通过抗炎活性追踪的方法首次从黑鱼鱼胆中提取分离得到牛黄胆酸钠和牛黄鹅去氧胆酸钠，并通过体外小鼠脾淋巴细胞增殖实验和LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO，实验证明牛黄胆酸钠和牛黄鹅去氧胆酸钠可以通过抑制炎症介质诱导小鼠脾淋巴细胞的增殖和巨噬细胞炎症因子的释放共同发挥抗炎作用，经过实验对比发现，牛黄鹅去氧胆酸钠的抗炎作用优于牛黄胆酸钠，并且通过毒性实验发现对正常脾淋巴细胞和巨噬细胞均无毒性作用。
(致谢: 感谢中国药科大学徐寒梅教授、戚微岩老师对本文的指导，同时也感谢江苏高校优势学科建设工程的资助、中国药科大学多肽药物创制工程研究中心提供研究平台及实验室老师，同学的帮助。 )
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