2. 中国中医科学院西苑医院实验研究中心，北京 100091
2. Experiment Research Center of Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者最严重的微血管并发症之一。DR能导致不可逆的视力丧失，已经成为致盲的主要疾病[1]，DR与自由基介导的氧化损伤有关，氧化应激反应可调节细胞的生理功能和生化反应，在细胞增殖分化过程中发挥重要作用，并可导致细胞凋亡。视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)位于富含血管的脉络膜和视网膜神经上皮层之间，是视网膜重要的营养、维护和代谢组织，也是外血-视网膜屏障的重要组成部分，RPE因其特殊的位置和功能在DR的发生发展中扮演重要的角色[2]。甲基乙二醛(methylglyoxal，MGO)是糖酵解生成的活性二羰基化合物，在糖尿病患者血浆中大量积累[3]，MGO可以通过与氨基酸残基结合，经过复杂反应产生晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)，作为AGEs最具活性的前体物质，MGO被认为是引发糖尿病并发症的关键物质[4]。在糖尿病患者中，血糖升高导致AGEs在RPE基底膜中聚集，从而引起RPE的损伤[5]。
黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ)是中药黄芪的主要活性成分之一，现代药理学研究证明，AS-Ⅳ具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降糖和改善心血管疾病等药理作用[6]，并且AS-Ⅳ对糖尿病周围神经病变和糖尿病大鼠肾脏病变具有改善和治疗效果[7-8]，对糖尿病大鼠心肌细胞和糖尿病大鼠视网膜Müller细胞具有保护作用[9-10]。目前尚未见AS-Ⅳ对DR中RPE损伤保护作用的研究报道，本研究采用MGO诱导的ARPE-19细胞损伤为模型，探讨AS-Ⅳ对ARPE-19细胞的保护作用及分子机制，为AS-Ⅳ用于防治DR提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料ARPE-19细胞株购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司；AS-Ⅳ购自成都曼斯特生物科技有限公司，以二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解，配制成50 mmol·L-1的贮备液，-20℃保存，用时以无血清培养基稀释至所需浓度，实验中DMSO浓度小于0.1%。DMEM/F12(1 :1) 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司，青链霉素混合液(100×)购自北京索莱宝科技有限公司，Hoechst 33342、MGO购自美国Sigma公司，CCK-8由日本同仁化学研究所提供，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)测试盒由南京建成生物工程研究所提供，线粒体膜电位和活性氧检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，caspase-3、caspase-9检测试剂盒购自凯基生物技术股份有限公司，FITC Annexin Ⅴ凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体购自英国Abcam公司，抗PARP抗体购自美国CST公司，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、山羊抗兔二抗(HRP结合)购自康为世纪生物科技有限公司。
1.2 ARPE-19细胞培养ARPE-19细胞生长于含有10%胎牛血清、1×105 U·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的DMEM/F12培养基中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，每天换液，每3 d传代1次，选取对数期生长的细胞进行实验。
1.3 实验分组及药物处理 1.3.1 MGO最佳造模浓度的确定将处于对数期的细胞接种于96孔板中，每组5个复孔，每孔1×104个细胞，接种24 h后，将细胞分为对照组和不同浓度MGO组，弃去完全培养基，分别加入无血清培养基稀释的0.5、0.75、1、2 mmol·L-1 MGO溶液，对照组加入无血清培养基，孵育16 h。
1.3.2 AS-Ⅳ最佳作用浓度的确定将处于对数期的细胞接种于96孔板中，每组5个复孔，每孔1×104个细胞，接种24 h后，将细胞分为对照组、MGO组、MGO+5 μmol·L-1 AS-Ⅳ组、MGO+10 μmol·L-1 AS-Ⅳ组和MGO+20 μmol·L-1 AS-Ⅳ组，弃去完全培养基。对照组和MGO组加入无血清培养基，MGO+不同浓度AS-Ⅳ组加入含不同浓度AS-Ⅳ(5、10、20 μmol·L-1)的无血清培养基，孵育6 h后，MGO组和MGO+不同浓度AS-Ⅳ组加入MGO使其终浓度为1 mmol·L-1，孵育16 h。
1.4 CCK-8检测细胞活力选取对数期生长的ARPE-19细胞，接种于96孔板中(每孔1×104个)，培养24 h后，按以上分组进行实验，然后弃去完全培养基，加入含CCK-8(CCK-8 :无血清培养基=1 :9) 的无血清培养基100 μL，孵育2 h，用酶标仪在450 nm处检测吸光度值，计算细胞活力，每个实验重复3次。
1.5 细胞凋亡检测 1.5.1 Hoechst 33342细胞核荧光染色细胞经处理后，PBS洗2次，加入无血清培养基稀释的Hoechst 33342染色液，37℃避光染色15 min，PBS洗3次，每次5 min，然后利用高内涵成像系统拍照。
1.5.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染将处于对数生长期的细胞接种于6孔板中，每孔1.5×105个，细胞长满板底约80%时，按上述方法处理细胞，经胰酶消化后离心，用冷PBS洗细胞2次，将细胞重悬于100 μL 1×Binding Buffer中，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15 min，加入400 μL 1×Binding Buffer轻弹混匀，上机检测。
1.6 细胞内氧化应激水平检测 1.6.1 ROS染色细胞经处理后，用PBS洗2次，加入以无血清培基1 :1000稀释的DCFH-DA，37℃避光染色40 min后，无血清培基洗3次，然后加入Hoechst 33342每孔200 μL，染色15 min，PBS洗3次后利用高内涵成像系统拍照。
1.6.2 细胞内SOD和MDA检测细胞经处理后，消化收集细胞，利用超声破碎细胞，4℃、12 000 r·min-1离心5 min，取上清，按照试剂盒说明进行SOD和MDA的检测。
1.7 线粒体膜电位检测细胞经处理后，用PBS洗2次，加入JC-1染色工作液37℃避光染色30 min，1×JC-1染色缓冲液洗3次，然后利用高内涵成像体统拍照。
1.8 Western blot检测蛋白表达细胞经处理后，胰蛋白酶消化并收集细胞，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的哺乳动物蛋白抽提试剂(体积比为1 :1 :98)，冰上裂解30 min；4℃、12 000 r·min-1离心15 min，取上清稀释10倍进行蛋白定量；将SDS-PAGE上样缓冲液与蛋白样品按照1 :4混匀，煮沸5 min，使蛋白充分变性，-20℃保存待用。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳3 h，转膜105 V，55 min，然后将NC膜用5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗孵育过夜，用TBST洗3次，每次15 min，二抗室温孵育2 h，TBST洗3次，每次15 min，显色后使用凝胶成像仪进行成像。使用Photoshop图像处理软件对蛋白条带的灰度值进行分析。
1.9 统计学分析实验结果以x±s表示，采用SPSS17.0进行统计学处理，以单因素方差分析(One-way ANOVA)方法进行分析。
2 结果 2.1 MGO造模浓度及AS-Ⅳ作用浓度的确定随着MGO浓度的增加，ARPE-19细胞活力逐渐下降，当MGO浓度为1 mmol·L-1时细胞存活率为(64.75±6.00)%(Fig 1A)，故选择1 mmol·L-1 MGO孵育16 h作为最佳造模条件；在不同浓度AS-Ⅳ预给药6 h后给予MGO(1 mmol·L-1)孵育16 h，结果显示，AS-Ⅳ浓度为10 μmol·L-1时，细胞存活率为(78.45±5.90)%，与MGO组相比细胞活力明显提高(P < 0.05)，最终确定AS-Ⅳ的给药浓度为10 μmol·L-1，并且在AS-Ⅳ浓度为10 μmol·L-1时对ARPE-19的细胞活力无明显影响(Fig 1B，P > 0.05)。
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| Fig 1 Effect of AS-Ⅳ on cell viability of ARPE-19 cells A: MGO can reduce ARPE-19 cell viability in a dose-dependent manner; B:AS-Ⅳ can inhibit the reduction of ARPE-19 cell viability induced by MGO. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 vs MGO group |
利用Hoechst 33342对细胞核染色发现，正常组细胞核呈圆形或椭圆形，完整无皱缩，呈均匀淡蓝色；MGO组细胞核着色不均匀，部分细胞核固缩呈致密亮蓝着色，表现出凋亡的典型特征；AS-Ⅳ给药后细胞核染色较为均匀，与MGO组比较有明显改善(Fig 2A)。Annexin Ⅴ-FITC/PI双染结果显示，正常组细胞凋亡率为(3.18± 0.30)%，MGO组细胞凋亡率为(19.47±2.48)%，与正常组相比凋亡率明显增加(P < 0.05)，AS-Ⅳ给药后细胞凋亡率为(7.57±0.81)%，与MGO组相比凋亡率明显降低(Fig 2B、2C，P < 0.05)。
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| Fig 2 Effect of AS-Ⅳ on ARPE-19 cell apoptosis by MGO A: Morphology of cell nucleus observed by Hoechst 33342 staining; B, C: Results of induced cell apoptosis rates examined by Annexin Ⅴ-FITC/PI with flow cytometry. #P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 vs MGO group |
荧光探针DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，可被细胞内的酯酶水解成DCFH，而DCFH不能通过细胞膜，细胞内的ROS可以将无荧光的DCFH氧化成有绿色荧光的DCF，因而绿色荧光的强度代表细胞内ROS的含量。由Fig 3A、3B可见，与对照组相比，MGO能增加ARPE-19细胞氧化应激反应，细胞绿色加深，荧光强度是对照组的(2.69±0.56) 倍，有显著性差异(P < 0.05)，AS-Ⅳ能够明显减少ROS的产生(P < 0.05)；且与对照组相比，MGO组细胞内SOD含量明显降低，MDA含量明显增加，AS-Ⅳ能明显增加SOD水平，减少MDA含量(Fig 3C、3D，P < 0.05)。
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| Fig 3 Effect of AS-Ⅳ on MGO-induced oxidative stress in ARPE-19 cells A, B: AS-Ⅳ can significantly inhibit MGO-induced increase of ROS; C: AS-Ⅳ can significantly inhibit MGO-induced decrease of SOD activity; D: AS-Ⅳ can significantly inhibit MGO induced increase of MDA content. #P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 vs MGO group |
JC-1荧光探针能够快速灵敏的检测线粒体膜电位的变化，正常细胞线粒体膜电位较高，JC-1以聚合物的形式存在于线粒体基质中，产生红色荧光；细胞受到损伤时线粒体膜电位降低，JC-1以单体形式存在，呈现绿色荧光。由Fig 4A、4B可见，对照组细胞红色荧光较强，线粒体膜电位较高，而MGO组细胞受损，线粒体膜电位下降，绿色荧光增强，Red/Green比值为(0.66±0.11)，明显低于正常组，AS-Ⅳ能够提高线粒体膜电位，红色荧光增加，绿色荧光减少，与MGO组相比Red/Green比值明显提高(P < 0.05)。
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| Fig 4 Effect of AS-Ⅳ on mitochondrial membrane potential in ARPE-19 cells A, B: AS-Ⅳ can significantly inhibit MGO-induced decrease of mitochondrial membrane potential in ARPE-19 cells. #P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 vs MGO group |
Western blot法检测凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达发现，MGO能明显减少Bcl-2/Bax比值，AS-Ⅳ给药后Bcl-2/Bax比值和PARP的表达明显增加(Fig 5A~5C，P < 0.05)。经荧光酶标法检测发现，MGO组caspase-9、caspase-3活力明显增加，AS-Ⅳ能明显降低caspase-9、caspase-3的活化水平(Fig 5D、5E，P < 0.05)。
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| Fig 5 Effect of AS-Ⅳ on expression of apoptosis related protein in ARPE-19 cells A ~ C: AS-Ⅳ up-regulates ratio of Bcl-2/Bax and expression of PARP detected by Western blot; D, E: AS-Ⅳ down-regulates activity of caspase-9 and caspase-3. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 vs MGO group |
MGO是机体产生的生理代谢产物，健康人体内MGO的浓度约为1 μmol·L-1。糖尿病患者因长期处于高糖状态，体内MGO大量产生并蓄积，MGO浓度为正常人的2 ~ 4倍，并且与血糖水平呈正相关，MGO成为加速DR进展的有害物质[11]。
MGO通过与蛋白质、磷脂和核苷酸形成AGE加合物改变细胞结构和功能[12]。本研究采用MGO损伤的ARPE-19作为细胞模型，研究AS-Ⅳ对ARPE-19细胞的保护作用。结果表明，AS-Ⅳ能够明显抑制MGO诱导的ARPE-19细胞活力的下降；对细胞进行Hoechst 33342染色和Annexin Ⅴ-FITC/PI双染，发现AS-Ⅳ对细胞核的形态有明显的改善作用，能够减少细胞核皱缩，使细胞核呈均匀蓝染，并且能够明显抑制MGO引起的细胞凋亡。
氧化应激水平的增强在糖尿病并发症(如DR)的发生中起着重要作用[13]，ROS的大量产生，破坏了机体内抗氧化防御系统的平衡，导致脂质过氧化物的产生。已有研究显示[14-15]，MGO能诱导成骨细胞和内皮细胞氧化应激的产生。本研究发现，MGO通过升高ARPE-19细胞的氧化应激水平而引起细胞损伤，AS-Ⅳ给药后能够减少ROS产生，提高SOD活力，降低MDA水平，从而减轻MGO对ARPE-19细胞造成的损害。由此表明AS-Ⅳ通过抗氧化作用减少氧自由基的产生，提高细胞内的抗氧化酶活性减少脂质过氧化物的产生，从而增强细胞的抗氧化能力。
线粒体的完整性对于细胞的生存至关重要，正常的线粒体膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷的先决条件[16]。活性氧自由基的异常升高能够引起线粒体内膜发生变化，一方面引起线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore, MPTP)开放，促凋亡蛋白细胞色素C等被释放至胞质中；另一方面导致线粒体膜电位降低，线粒体膜电位下降是细胞凋亡的早期信号[12]。胞质中的细胞色素C结合并激活APAF-1和caspase-9前体，形成凋亡体，caspase-9前体以这种方式聚集并导致caspas-9的激活，继而活化caspas-3启动caspase级联反应，引发细胞凋亡[17]。Bcl-2家族蛋白对线粒体通路有重要的调控作用，抗凋亡蛋白Bcl-2能够抑制MPTP的开放，减少细胞色素C及凋亡诱导因子的释放，阻止凋亡的发生；促凋亡蛋白Bax正常情况下以单体形式存在于细胞质中，受到凋亡刺激时构象发生变化，导致Bax寡聚体形成并整合到线粒体外膜上，促进细胞色素C的释放，诱导凋亡的发生[18]。通常用Bcl-2和Bax蛋白表达的比率(Bcl-2/Bax)来表示细胞的凋亡情况。本研究发现，MGO可影响Bcl-2家族蛋白的表达，明显降低Bcl-2/Bax比率，提高caspase家族蛋白caspase-9和caspase-3的表达水平，减少caspase-3裂解底物PARP的表达，从而促进ARPE-19细胞凋亡。而AS-Ⅳ能逆转MGO能引起的ARPE-19细胞线粒体膜电位的下降。明显提高Bcl-2/Bax率，下调caspase-9和caspase-3的表达，提高PARP的水平，抑制ARPE-19细胞凋亡。表明AS-Ⅳ通过调节线粒体通路蛋白的表达发挥保护细胞的作用，至于AS-Ⅳ是否通过其他途径如内质网通路和MAPK通路对ARPE-19细胞起保护作用仍需要进一步的研究。
综上所述，AS-Ⅳ能够通过增强细胞的抗氧化能力，提高线粒体膜电位，调节线粒体通路中相关蛋白的表达，从而抑制MGO引起的氧化应激和细胞凋亡，对ARPE-19细胞起到保护作用，并可能在DR中发挥治疗作用。
(致谢: 本研究所有实验均在中国医学科学院&北京协和医学院药用植物研究所中药(天然药物)创新药物研发北京市重点实验室进行，感谢中国中医科学院西苑医院实验中心老师们的倾力协助，感谢陈阳老师对实验及文章撰写提供的帮助。 )
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