2. 抗炎免疫药物教育部重点实验室，安徽 合肥 230032;
3. 安徽医科大学肝病研究所，安徽 合肥 230032
2. The Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune medicines, Ministry of Education, Hefei 230032, China;
3. Institute for Liver Diseases of Anhui Medical University, Hefei 230032, China
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫炎症疾病，其主要特征是关节肿胀与不可逆性的损坏，慢性的滑膜炎症[1]。成纤维滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)在RA发病中显示出独特的特性，参与血管新生，免疫应答，关节损伤等过程，并产生炎性细胞因子促进炎症的发生[2]，慢性炎症导致多种炎症因子异常并使关节损伤[3]。文献报道，特定基因的甲基化参与RA的发病[4]，甲基CpG结合蛋白2(methyl CpG binding protein 2，MeCP2) 是MBD家族的成员，可以特异性的识别和绑定在甲基化的DNA序列上，从而抑制基因的转录，也可招募甲基化酶，组蛋白去乙酰化酶甲基化DNA[5]。
Hedgehog信号通路对组织的形态和生长给予调控，Patch1(PTCH1) 在此通路中是一个负调控基因[6]。目前研究表明[7-8]，在胃癌、肝细胞癌等癌症中，癌细胞异常增殖，PTCH1基因发生高甲基化。RA中FLS呈肿瘤细胞样增殖[9]，鉴于癌症与RA在细胞增殖方面的共性，靶向调控PTCH1基因的甲基化，可能成为治疗RA的新疗法。橙皮素是二氢黄酮的一种，有着抗氧化和抑制炎症介质产生的药理作用[10]。为了克服半衰期短，口服给药后失效快的问题，本课题组设计合成了橙皮素衍生物XIV号(hesperidin derivative-XIV，HDND-XIV)，并进行抗炎筛选，其化学式为C34H32Cl2N2O6，分子质量为635.5380，结构如Fig 1。
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| Fig 1 Chemical formula |
因佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型具有与RA相似的病理学特征和免疫学变化，所以广泛用于研究RA的发病和筛选新药治疗风湿性疾病[11]，本实验即采用AA大鼠为动物模型，重点研究HDND-XIV对PTCH1基因甲基化的调控。基于FLS在RA发病中的重要作用，以FLS为研究对象，通过观察HDND-XIV对AA FLS分泌白介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的影响和对AA FLS表达MeCP2，PTCH1和Hedgehog信号通路相关蛋白Gli1和Shh的影响，以及HDND-XIV对PTCH1基因甲基化的调控，研究HDND-XIV抑制FLS炎症可能存在的机制，为防治RA提供理论依据。
1 材料 1.1 实验动物清洁级♂Sprague Dawley(SD)大鼠30只，体质量(200±20) g，购自安徽医科大学动物实验中心。温度：(25±1)℃，湿度：40%~75%，自由饮食饮水。
1.2 药物与试剂HDND-XIV由安徽医科大学药学院提供，浓度为0.1 mol·L-1；弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant，FCA)及噻唑蓝MTT购自美国Sigma公司；澳洲胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；高糖DMEM购自Hyclone公司；lipofectamine 2000转染试剂盒及Opti-MEM购自Invitrogen公司；MeCP2抗体及Shh抗体购自Abcam公司；β-actin抗体购自北京中杉金桥公司；Gli1及PTCH1抗体购自北京Bioss公司；IL-6、TNF-α、IL-1β酶联免疫试剂盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)购自武汉Elabscience公司；辣根标记山羊抗兔IgG及辣根标记山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥公司。
1.3 仪器NAPCO-6100型细胞培养箱购自美国SHELLAB公司；Western blot电泳仪购自美国BIO-RAD公司；酶标仪购自BioTek公司。
2 方法 2.1 动物模型的制备实验动物随机分为正常组、AA组，每组15只。适应性喂养1周后，每只大鼠左后足趾皮内注射FCA(0.01 ml·kg-1)，制备AA大鼠，即模型组大鼠。左后足趾皮内注射等量的PBS，作为正常对照组大鼠。
2.2 原代FLS的提取与培养造模24 d后将大鼠处死，在新洁尔灭溶液中浸泡约15 min，沿膝关节正中纵行切开并分离肌肉，关节囊的滑膜层和纤维层，取出滑膜组织，每只大鼠可采集15 mg~20 mg。将取出的滑膜组织用Hank′s液反复洗3次，洗至白色再在DMEM中清洗3次。剪成1 mm3的小块，剪的过程中保持组织块的湿润。将细胞培养瓶底板浸润DMEM培养基，用吸管分别将剪成小块的组织均匀地平铺在底板上，加入含FBS的DMEM培养基，FBS的体积分数为0.2。培养瓶倒置于37 ℃培养箱中培养6~8 h后，正置继续培养，3 d后可观察到个别组织周围出现稀少的滑膜细胞，此时换液。6 d后个别组织周围细胞生长紧密，即可除去组织。9 d后传代，为第1代FLS细胞，消化细胞并进行培养，实验所用FLS为3代~5代。
2.3 半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)的检测 2.3.1 MTT法检测HDND-XIV的IC50值实验分组，正常FLS组：与AA FLS做对照；AA FLS组：与HDND-XIV处理组作对照；HDND-XIV处理组：400、200、100、50、25、12.5 μmol·L-1。实验重复3次。
2.3.2 步骤将对数生长期的FLS消化成细胞悬液，以2×104个/孔的密度接种于96孔板中，37 ℃过夜。细胞贴壁后各浓度组加入HDND-XIV刺激，作用48 h后将孔内液体换成无血清的培养基，加入MTT(5 g·L-1)，每孔20 μL，37℃作用4 h。然后将孔内液体吸净，每孔加入150 μL DMSO，室温震荡后，将96板放在酶标仪上检测吸光度(A)，波长为490 nm。
2.4 ELISA分析IL-6、TNF-α、IL-1β水平将对数生长期FLS消化成细胞悬液并接种于24孔板内，每孔1×106个，待细胞长满时，分别加入不同浓度的HDND-XIV进行刺激，每组3个复孔。实验分组为正常组，AA组，AA加HDND-XIV组(80、40、20、10、5 μmol·L-1)。HDND-XIV作用24 h后，吸取细胞培养基上清，4℃，3 000 r·min-1，离心1 min, 收集上清液，ELISA法检测炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的含量。
2.5 Western blot检测MeCP2、PTCH1、Gli1和Shh将对数生长期FLS接种于6孔板中，待24 h贴壁后，每孔内加入2 mL DMEM，并在AA组上加HDND-XIV刺激，分正常组、AA组、AA加HDND-XIV组(10 μmol·L-1)。作用48 h后，每孔加250 μL RIPA裂解液(1 mL裂解液中加10 μL PMSF)，冰上裂解30 min，将裂解的混合物移到EP管中。4℃，12 000 r·min-1，离心30 min，离心结束后移取上清至新的EP管中，加入蛋白上样缓冲液，100℃恒温10 min使蛋白变性。将提取的蛋白样品每孔上样15 μL，进行电泳分离，并转膜到PVDF膜上。在体积分数为0.05的脱脂奶粉下封闭2 h，TBST漂洗3次后，于4 ℃中孵一抗过夜。一抗稀释的比例为：PTCH1(1 :200)、MeCP2(1 :1 000)、Gli1(1 :200)、Shh(1 :1 000)、β-actin(1 :1 000)。在TBST漂洗3次后，加入和一抗匹配的二抗(1 :10 000)，孵育1 h，再在TBST中漂洗3次，用ECL发光试剂盒进行显影。
2.6 焦磷酸测序分析使用Axygen DNA提取试剂盒提取出基因组DNA，并用亚硫酸盐对DNA进行修饰。PTCH1引物序列上游引物：5′-AGTTGGGAGTTTTTTAGATGATAGG-3′，下游引物：5′-CCAA AAAACCCCACCTTAATCTCTTTCA-3′，PTCH1测序引物：5′-GGAGTTTTTTAGATGATAGGTTTA-3′，扩增后，使用QIAGEN焦磷酸测序仪测序。
2.7 过表达质粒GV230-MeCP2的转染使用脂质体(lipofectamine 2000) 转染过表达质粒GV230-MeCP2入AA FLS，对照组AA FLS转染空载体GV230。转染前1天，将FLS接种于6孔板中，加入含FBS的DMEM培养基，在37℃培养箱中培养。待细胞快长满时，即可用于实验。取5 μL质粒与200 μL Opti-MEM轻柔混合，温室孵育5 min，同时另取5 μL脂质体同样与200 μL Opti-MEM轻柔混合并孵育5 min。将上述两种混合液轻柔混合，并在室温孵育25 min，形成复合体。取出6孔板，弃去原培养基并用PBS清洗3次，每孔加入1.6 mL Opti-MEM，将上述孵育好的复合体，轻揉均匀的加入相应的孔中并混合均匀，置于37℃培养箱中培养6 h后，换成含FBS的DMEM培养基继续培养。对照组操作方法同上。
2.8 统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计分析，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用q检验。
3 结果 3.1 不同浓度的HDND-XIV对FLS增殖的影响由Fig 2的MTT分析可知，AA组FLS的吸光度值大于正常组FLS，且差异具有统计学意义(P < 0.01)，说明AA组的增殖速率大于正常组。加入不同浓度的HDND-XIV(400、200、100、50、25、12.5 μmol·L-1)刺激48 h后，随着HDND-XIV浓度的减小，吸光度值在增加(P < 0.01)，说明HDND-XIV具有一定的毒性，并根据吸光度值计算出IC50值为161 μmol·L-1。
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| Fig 2 Effect of HDND-XIV on proliferation in AA FLS(x±s, n=3) Lane 1:Control group; Lane 2:AA group; Lane 3~8:400, 200, 100, 50, 25, 12.5 μmol·L-1 HDND-XIV treated AA group.**P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs AA group |
鉴于HDND-XIV毒性，在小于0.5倍的IC50范围里，如Fig 3，选择5个浓度点(80、40、20、10、5 μmol·L-1)，在AA组FLS上进行HDND-XIV抗炎活性的筛选，结果表明AA组FLS细胞上清中IL-6，TNF-α，IL-1β分泌大于正常组(P < 0.01)，且差异具有统计学意义，随着HDND-XIV浓度的减小，其分泌在一定范围内呈下降的趋势(P < 0.01，P < 0.05)，当HDND-XIV浓度为10 μmol·L-1时，含量最低。
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| Fig 3 Effect of HDND-XIV on level of IL-6(A), IL-1β(B), TNF-α(C)(x±s, n=3) Lane 1:Control group; Lane 2:AA group; Lane 3~7:80, 40, 20, 10, 5 μmol·L-1 HDND-XIV treated AA group.**P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs AA group |
根据ELISA筛选的结果，在AA组FLS上加HDND-XIV刺激，刺激浓度为10 μmol·L-1。如Fig 4所示，与正常组FLS相比，AA组FLS中PTCH1的表达下降(P < 0.01)，MeCP2，Gli1和Shh蛋白表达升高(P < 0.01)，并差异具有统计学意义。加入HDND-XIV以10 μmol·L-1浓度刺激48 h后，相比较AA组FLS，AA加HDND-XIV组中PTCH1蛋白表达升高(P < 0.01)，MeCP2，Gli1和Shh蛋白表达下降(P < 0.01)，差异具有统计学意义。
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| Fig 4 Effect of HDND-XIV on PTCH1, MeCP2, Gli1 and Shh protein expression in AA FLS(x±s, n=3) A, B, C:the protein expression of PTCH1, MeCP2, Shh and Gli1;HDND-XIV(10 μmol·L-1) treated AA group.**P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs AA group |
以10 μmol·L-1的浓度，在AA组FLS上加HDND-XIV刺激，分正常组，AA组，AA加HDND-XIV组。刺激48 h后，提取FLS的基因组DNA，用焦磷酸测序进行检测，结果如Fig 5。每组均检测了4个位点，正常组PTCH1基因启动子4个位点Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4甲基化程度分别为0%、9%、41%、0%；AA组PTCH1基因启动子4个位点Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4甲基化程度分别为63%、67%、62%、63%；AA加HDND-XIV组PTCH1基因启动子4个位点Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4甲基化程度分别为28%、32%、48%、26%。根据文献指出[12]，50%以上定义为高甲基化，20%~50%定义为低甲基化，20%以下定义为无甲基化。正常组Pos.1、Pos.2、Pos.4位点的甲基化程度分别为0%、9%、0%，视为无甲基化；AA组Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4位点均高于50%，视为高甲基化；AA加HDND-XIV组Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4位点均在20%~50%，视为低甲基化。说明AA组FLS甲基化程度高于正常组(P < 0.01)，经HDND-XIV刺激后，AA组甲基化程度降低(P < 0.01)。
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| Fig 5 PTCH1 gene promoter methylation level detected by pyrosequencing(x±s, n=3) A:PTCH1 gene promoter methylation level.B:Lane 1:Control group; Lane 2:AA group; Lane 3:HDND-XIV(10 μmol·L-1) treated AA group.**P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs AA group |
在AA FLS中转染GV230-MeCP2过表达质粒，对照AA FLS组转染GV230空载体，转染成功后均加入HDND-XIV，HDND-XIV的终浓度为10 μmol·L-1。分组如Fig 6，结果显示成功转染GV230-MeCP2，MeCP2表达上升，且与AA组MeCP2表达无差异，但与AA加HDND-XIV组相比差异具有统计学意义(P < 0.01)，说明过表达成功。成功过表达MeCP2后，相比较AA加HDND-XIV组，PTCH1蛋白表达下降(P < 0.01)，Gli1和Shh蛋白表达增加(P < 0.01)，并且炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌也增加，差异具有统计学意义(P < 0.01)。
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Fig 6 AA-FLS transfected with plasmid GV230-MeCP2(x±s, n=3)
The MeCP2, PTCH1, Gli1 and Shh protein expressions was detected by western blot(A, B, C) and the level of IL-6, IL-1β, TNF-α was detected by ELISA(D) Lane 1:Control group; Lane 2:AA group; Lane 3:HDND-XIV(10 μmol·L-1) treated AA group; Lane 4:HDND-XIV(10 μmol·L-1) and GV230-MeCP2 treated AA group; Lane 5:HDND-XIV(10 μmol·L-1) and GV230 treated AA group.**P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs AA group |
RA是一种滑膜炎症疾病，其发病机制尚不清楚。炎症因子被认为是发病不可缺少的一部分，其在类风湿关节炎中的紊乱会造成炎症性的关节损伤[13]。本实验在体外采用MTT和ELISA证明了HDND-XIV具有明显的抗炎活性，并对HDND-XIV产生抗炎作用的机制经行了探究。橙皮素是二氢黄酮的一种，为了克服其较低的生物利用度，本实验室合成了一系列橙皮素衍生物，前期预实验初步证明HDND-XIV可能具有良好的抗炎活性，MTT法检测6个不同HDND-XIV浓度点对AA FLS的影响，显示HDND-XIV具有一定的毒性。炎症指标的高低可以反映药物的抗炎活性，鉴于HDND-XIV的毒性，在小于0.5倍IC50范围里选择5个浓度点加药刺激，检测各组炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的含量，显示随着HDND-XIV浓度的降低，细胞培养基中IL-6、TNF-α、IL-1β的浓度呈现下降的趋势，HDND-XIV浓度为10 μmol·L-1时含量最低，说明此时HDND-XIV的抗炎活性最强。
文献报道，Hedgehog信号通路在组织修复以及持续的慢性炎症中发挥着重要作用[14]。因此，实验中检测了Hedgehog信号通路相关蛋白的表达来探究HDND-XIV发挥抗炎作用的机制。Western blot(Fig 4)的结果显示，经HDND-XIV作用后，AA FLS中PTCH1蛋白表达增加，Gli1和Shh蛋白表达减少，说明AA FLS中Hedgehog信号通路可能受到了HDND-XIV的抑制。蛋白质的表达受到多种因素的影响，如转录、翻译等环节，其中DNA甲基化是表观遗传学修饰的一种，可以抑制基因的转录，阻止蛋白的表达。有研究表明特定基因的甲基化参与了RA的发病[4, 15]。在RA中，不同基因的甲基化状态和程度有所不同。一些基因，如凋亡诱导基因，抗炎因子基因发生高甲基化，导致其基因表达水平降低，促进了RA的发病。另外一些基因，如促炎因子基因甲基化水平降低，导致其表达水平上升，促进RA的发病。为了探究HDND-XIV是否通过调控PTCH1基因的甲基化，从而增加PTCH1蛋白的表达，产生抗炎作用。本研究采用了焦磷酸测序技术定量检测了各组PTCH1基因的甲基化程度。结果显示AA FLS中PTCH1基因的甲基化程度明显高于正常组FLS，表现为高甲基化状态，经HDND-XIV刺激后，PTCH1基因甲基化程度明显降低，表现为低甲基化状态。说明HDND-XIV可能是通过抑制PTCH1基因甲基化，增加PTCH1蛋白的表达产生抗炎作用。文献报道MeCP2与DNA甲基化密切相关，其可以特异性的识别和绑定在甲基化的DNA序列上, 从而抑制基因的表达[5]。MeCP2的增多反映甲基化水平发生整体的上调。为了探究HDND-XIV是否通过作用于MeCP2来调控PTCH1基因的甲基化，我们在AA FLS上转染过表达质粒GV230-MeCP2，然后再加入HDND-XIV，显示成功过表达MeCP2后，PTCH1蛋白表达明显减少，Gli1和Shh蛋白表达增加，说明Hedgehog信号通路被激活，同时该组的细胞培养基中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量较AA FLS加HDND-XIV组也增加。说明HDND-XIV可能是通过下调MeCP2蛋白的表达，使PTCH1基因甲基化程度降低，增加了PTCH1蛋白的表达，抑制了炎症因子的释放。
综上所述，HDND-XIV可在体外抑制FLS的炎症，其抗炎的作用可能与抑制PTCH1基因甲基化有关，通过下调MeCP2蛋白的表达，使PTCH1基因的甲基化程度降低，增加PTCH1蛋白的表达，从而抑制了Hedgehog信号通路，下调了炎症指标。提示HDND-XIV可能是通过调控特定基因的甲基化缓解FLS的炎症，初步说明HDND-XIV治疗RA有一定的疗效。本实验探讨了HDND-XIV对AA大鼠FLS炎症的影响及可能的分子机制，使橙皮素类药物在临床的应用等方面具有积极的意义。
( 致谢: 本实验在安徽医科大学药学院科教大楼实验室完成，特别感谢我的导师李俊教授给予我细心的指导与教诲，感谢我的师兄师姐，在实验进展与论文撰写中给予我帮助，在此一并表达我诚挚的谢意。 )
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