糖尿病肾病 (diabetic nephropathy，DN) 是一种慢性炎症反应性疾病[1]。目前大量研究表明，巨噬细胞是一种重要的炎症细胞，可以产生趋化因子、致炎因子、炎症介质等参与炎症反应，肾组织内巨噬细胞的浸润及活化是促进DN进程的重要原因[2]。最近研究显示，糖尿病肾组织中巨噬细胞炎性反应受到TLR2/4通路的介导和调节[3]。TLR2/4通路在糖尿病炎症过程中发挥了重要作用，可通过特异性识别多种病原相关分子模式 (PAMPs)，启动信号转导通路，促使巨噬细胞分泌大量细胞因子，介导炎性反应。因此，抑制TLR2/4通路信号途径，可能是干预DN进展的途径之一。芍药苷 (paeoniflorin，PF) 为传统中药芍药的主要成分，是一种单萜类糖苷化合物，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、免疫调节等作用[4-5]。研究证实，PF可通过抑制TLR2信号通路减少巨噬细胞的活化[6]，并可抑制晚期糖基化终末产物 (advanced glycation end products，AGEs) 诱导的肾小球系膜细胞的氧化损伤和炎症[7]。鉴于以上认识，在本实验中，我们通过AGEs刺激巨噬细胞建立炎症模型[8]，了解PF对TLR2/4信号通路及其相关炎性因子的影响，探讨PF对DN的保护作用及机制，为DN的治疗提供新思路。
1 材料与方法 1.1 材料芍药苷 (南京广润生物制品有限公司)，AGEs、BSA (北京博奥森生物技术有限公司)，RAW264.7巨噬细胞 (上海细胞库)，人氧化磷脂 (TLR2/4特异性抑制剂，OxPAPC, 美国Invivogen公司)，CCK-8试剂盒 (南京诺唯赞生物科技有限公司)，兔抗TLR4、MyD88、TRIF、iNOS多克隆抗体 (美国Abcam公司)，兔抗IRF3、p-IRF3、NF-κB p65、NF-κB p-p65多克隆抗体 (美国Cell Signaling公司)，兔抗TLR2多克隆抗体 (美国EMD Millipore公司)，兔抗p-IRAK1多克隆抗体 (美国Santa Cruz公司)，兔抗IL-1β多克隆抗体、小鼠抗TNF-α、MCP-1、β-actin单克隆抗体、辣根酶过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体 (武汉三鹰生物技术有限公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒 (上海碧云天生物技术有限公司)，TLR2、TLR4引物及探针 (美国GeneCopoeia公司)，GAPDH引物及探针 (上海生工生物工程有限公司)，TRIzol试剂 (美国Invitrogen公司)，TNF-α和IL-1β ELISA试剂盒 (美国R & D Systems公司)，MCP-1 ELISA试剂盒 (北京瑞博奥生物科技有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 RAW264.7巨噬细胞的培养复苏后的RAW264.7巨噬细胞生长于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。
1.2.2 细胞活力测定将处于对数生长期的RAW264.7巨噬细胞置于96孔培养板中，培养基中胎牛血清含量为3%，调整每孔细胞数为5×104，孵育24 h使细胞同步化，预先1 h给予不同浓度的芍药苷处理细胞后，分别将其置于含200 mg·L-1的AGEs的培养基中孵育24 h，然后每孔加入10 μL CCK-8孵育4 h。使用波长为490 nm的酶标仪测定每孔的吸光度值。
1.2.3 实验条件的优化采取同一浓度AGEs刺激RAW264.7巨噬细胞，选取不同时间点收集细胞，提取总蛋白，观察TLR2/4、iNOS蛋白表达，以确定AGEs刺激最佳时间。使用不同浓度PF预先1 h干预巨噬细胞，AGEs刺激24 h后收集细胞，提取总蛋白，选取TLR2/4、iNOS蛋白表达抑制最明显的PF干预浓度，作为后期实验分组中的PF干预浓度。
1.2.4 实验分组将RAW264.7巨噬细胞随机分为对照组 (DMEM培养基孵育)、BSA组 (200 mg·L-1 BSA孵育)、AGEs组 (200 mg·L-1 AGEs)、PF组 (200 mg·L-1 AGEs+10-5 mol·L-1 PF) 和TLR2/4抑制剂组 (200 mg·L-1 AGEs+30 mg·L-1 OxPAPC)，各组处理完毕后收集细胞。
1.2.5 Western blot检测各组细胞蛋白表达收集接种于6孔板中的RAW264.7巨噬细胞，加入RIPA裂解液，离心取上清液，BCA法测定各组蛋白含量。加入5×上样缓冲液，100℃水浴变性提取蛋白，并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，经转膜仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜 (NC) 后，经5%脱脂奶粉室温封闭2 h。分别加入TLR2抗体 (1 :800)、TLR4抗体 (1 :500)、MyD88抗体 (1 :500)、p-IRAK1抗体 (1 :1 000)、TRIF抗体 (1 :1 000)、IRF3抗体 (1 :1 000)、p-IRF3抗体 (1 :1 000)、NF-κB p-p65抗体 (1 :1 000)、NF-κB p65抗体 (1 :1 000)、iNOS抗体 (1 :1 000)、TNF-α抗体 (1 :500)、IL-1β抗体 (1 :500)、MCP-1抗体 (1 :500) 和β-actin抗体 (1 :35 000)4℃过夜，次日使用PBST洗膜后，加入辣根酶过氧化物酶标记的二抗 (1 :8 000) 室温孵育1 h，再次洗膜。将NC膜放入暗室滴加ECL发光剂，曝光并显影，在IQTL8.1软件系统中测定条带光密度值。
1.2.6 实时定量PCR检测各组细胞mRNA的表达使用TRIzol试剂裂解细胞，并根据说明书提取总RNA，溶解于DEPC水中，用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，要求OD260/OD280值为1.8~2.0。使用反转录试剂盒合成cDNA。GAPDH引物由上海生工生物技术公司合成：上游5′-ACCCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3′，下游5′-GGCCCCTCCTGTTATTATGGGGGT-3′。下列引物GeneCopoeia公司合成：TLR2：货号MQP030650；TLR4：货号MQP032465，以此为模版，进行PCR扩增。GAPDH作为校正内参照，根据2-ΔΔct方法测定目标基因mRNA转录水平。
1.2.7 ELISA法检测细胞因子的水平收集细胞培养上清液，依据ELISA试剂盒说明书进行操作，所有实验标本及标准品做复孔检测，使用酶标仪测量450 nm的吸光度值，绘制标准曲线，通过样本的OD值，从标准曲线上得到TNF-α、IL-1β、MCP-1的浓度。
1.2.8 统计学处理采用SPSS 16.0软件分析，正态分布资料的数据采用x±s表示，方差齐性检验用Levene法，统计学处理采用单因素方差分析 (one-way ANOVA)，组间差异性检验采用LSD。
2 结果 2.1 PF对AGEs刺激下RAW264.7巨噬细胞活性的影响选取10-8 ~10-3 mol·L-1范围内的6种PF浓度，如Fig 1所示，当PF浓度在10-8 ~10-4 mol·L-1时，对AGEs刺激下RAW264.7巨噬细胞的活性无明显影响 (P>0.05)，PF浓度为10-3 mol·L-1时，对细胞的活性有影响 (P＜0.05)。
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| Fig 1 Viability analysis of RAW264.7 cells after treatment with paeoniflorin (10-8~10-3 mol·L-1) in AGEs-induced RAW264.7 macrophages *P < 0.05 vs control group (0 mol·L-1) |
Western blot结果显示，TLR2于4 h后表达增强，24 h达高峰；TLR4于12 h后表达增强，24 h达高峰；iNOS于4 h后表达增强，24 h达高峰，与0 h时间点相比差异均有统计学意义 (P＜0.01)，见Fig 2。故明确最合适的培养时间为24 h。
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| Fig 2 Effects of AGEs on TLR2, TLR4 and iNOS protein in RAW264.7 macrophages determined by Western blot **P < 0.01 vs control group (0 h) |
Western blot结果显示，AGEs作用24 h后，巨噬细胞TLR2、TLR4及iNOS蛋白的表达均明显增加 (P＜0.01)；PF可抑制TLR2、TLR4及iNOS的表达，且抑制的程度与剂量相关，在实验选取的4个浓度 (10-8~10-5 mol·L-1) 中，PF浓度在10-5 mol·L-1时，对AGEs刺激下TLR2、TLR4及iNOS表达抑制作用最为明显，与AGEs刺激组比较差异有统计学意义 (P＜0.01)。见Fig 3，故选择最合适的PF浓度为10-5 mol·L-1。
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| Fig 3 Effects of PF on TLR2, TLR4 and iNOS protein in AGEs-induced RAW264.7 macrophages determined by Western blot 1:Negative control; 2:AGEs (200 mg·L-1); 3:AGEs+PF (10-5 mol·L-1); 4: AGEs+PF (10-6 mol·L-1); 5:AGEs+PF (10-7 mol·L-1); 6:AGEs+PF (10-8 mol·L-1).**P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs AGEs group |
p-p65、NF-κB p65、iNOS、TNF-α、IL-1β和MCP-1蛋白的表达变化Western blot结果显示，AGEs组TLR2、TLR4、MyD88、p-IRAK1、TRIF、IRF3、p-IRF3、NF-κB p-p65、NF-κB p65、iNOS、TNF-α、IL-1β和MCP-1蛋白的表达均明显高于对照组 (P＜0.01)，表明AGEs可上调上述巨噬细胞炎症因子的表达；与AGEs组相比，PF组和TLR2/4抑制剂组上述蛋白的表达均有所下降 (P＜0.01)，提示PF和TLR2/4抑制剂均可抑制AGEs刺激的上述巨噬细胞炎症因子的表达。见Fig 4。
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| Fig 4 Expression of TLR2, TLR4, MyD88, p-IRAK1, TRIF, IRF3, p-IRF3, NF-κB p-p65, NF-κB p65, iNOS, TNF-α, IL-1β and MCP-1 protein determined by Western blot in RAW264.7 macrophages 1:Control; 2:BSA (200 mg·L-1); 3:AGEs (200 mg·L-1); 4:PF (200 mg·L-1 AGEs+10-5 mol·L-1 PF); 5:TLR2/4 inhibitor (200 mg·L-1 AGEs+30 mg·L-1 OxPAPC).**P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs AGEs group |
实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，AGEs组TLR2和TLR4 mRNA的表达明显增加 (P＜0.01)；与AGEs组相比，PF组和TLR2/4抑制剂组TLR2和TLR4 mRNA的表达均明显降低 (P＜0.01)，见Fig 5。
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| Fig 5 Expression of TLR2 and TLR4 mRNA determined by real-time PCR in RAW264.7 macrophages 1:Control; 2:BSA (200 mg·L-1); 3:AGEs (200 mg·L-1); 4:PF (200 mg·L-1 AGEs+10-5 mol·L-1 PF); 5:TLR2/4 inhibitor (200 mg·L-1AGEs+30 mg·L-1 OxPAPC).**P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs AGEs group |
ELISA结果显示，AGEs组TNF-α、IL-1β及MCP-1的水平明显高于对照组 (P＜0.01)，PF组和TLR2/4抑制剂组TNF-α，IL-1β及MCP-1的水平均明显低于AGEs组 (P＜0.01)，见Fig 6。
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| Fig 6 Level of TNF-α, IL-1β and MCP-1 measured by ELISA in cell supernatant 1:Control; 2:BSA (200 mg·L-1); 3:AGEs (200 mg·L-1); 4:PF (200 mg·L-1 AGEs+10-5 mol·L-1 PF); 5:TLR2/4 inhibitor (200 mg·L-1 AGEs+30 mg·L-1 OxPAPC).**P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs AGEs group |
近年来，DN已成为终末期肾病的主要原因之一。DN临床和实验研究均提示巨噬细胞参与介导肾组织的炎症，且巨噬细胞在肾组织的浸润数量与肾损伤的严重性密切相关[9-10]。AGEs是一种蛋白质、脂质、核酸等大分子非酶糖化反应而形成的复杂化合物，在长期高血糖状态下，AGEs可大量生成[11]，并激活巨噬细胞内的MAPK、TLR4、NF-κB等多种信号通路，分泌IL-6、TNF-α等多种细胞因子，参与炎症反应，导致肾小球肥大、基底膜增厚等病理改变，进而加重肾功能的损害[12]。本实验采用AGEs刺激RAW264.7巨噬细胞，观察TLR2/4信号通路及相应炎症因子的表达。结果表明，与对照组相比，AGEs刺激后，RAW264.7巨噬细胞TLR2/4、其下游信号通路MyD88、p-IRAK1、TRIF、IRF3、p-IRF3、NF-κB p-p65、NF-κB p65、iNOS及促炎因子TNF-α、IL-1β、MCP-1的表达明显上调，也证实了AGEs可激活RAW264.7巨噬细胞介导炎症反应。
TLR2和TLR4均属于Toll样受体，是Ⅰ型跨膜受体蛋白，主要表达于抗原提呈细胞上，激活后可启动MyD88依赖途径，招募IRAKs家族与TRAF6相互结合，并活化NF-κB。NF-κB为Rel家族的转录因子，通常是指p50、p65组成的异源二聚体，静息时与抑制蛋白ⅠκB结合存在于细胞质中，当受到外界刺激时，与ⅠκB解离进入细胞核内，引起一些促炎细胞因子，如IL-1β、TNF-α及MCP-1的释放。此外，TLR4还可通过TRIF途径激活IRF3，从而进行信号传导，启动炎症反应[13-15]。Li等[16]研究表明，糖尿病大鼠肾组织中TLR2、NF-κB等表达明显增加，并伴有巨噬细胞的大量浸润。另有报道证实[17]，在STZ诱导的TLR4-/-小鼠与野生型 (WT) 小鼠糖尿病模型中, 发现WT小鼠肾组织中TLR4、IL-6及TNF-α等细胞因子表达明显高于TLR4-/-小鼠，与WT小鼠相比，TLR4-/-小鼠的蛋白尿、肾小球硬化以及肾小管的损伤明显减少。本实验中，我们采用TLR2/4抑制剂OxPAPC预处理AGEs刺激下的RAW264.7巨噬细胞后，与AGEs组相比，可见TLR2/4通路及相应炎症因子的表达明显降低，进一步表明TLR2/4可通过调节其下游信号通路参与RAW264.7巨噬细胞的激活。因此，抑制TLR2/4信号分子的传递，可能对DN的防治有着重要意义。
PF具有多种生物学作用，包括神经保护、促进肝细胞再生、诱导肿瘤细胞凋亡、抗风湿等，因其毒副作用小而被临床广泛应用[18-20]。已有研究表明，PF可降低糖尿病大鼠尿白蛋白排泄率，减少其肾组织巨噬细胞的浸润，并抑制ICAM-1、TGF-β及NF-κB的高表达，从而发挥抗炎作用，保护DN[21]。我们先前的实验也证实白芍总苷 (PF是白芍总苷主要活性成分) 对糖尿病大鼠的肾脏有一定的保护作用，这可能与抑制TLR2/4信号通路及相应炎症因子的高表达相关[22]。本实验中，我们预先给予不同浓度的PF处理细胞，然后采用AGEs作为刺激因素诱导RAW264.7巨噬细胞活化，CCK-8细胞活性实验表明，当PF浓度小于10-4 mol·L-1孵育时，几乎不影响AGEs刺激下的RAW264.7巨噬细胞生长。在优化实验条件时，通过观察同一浓度AGEs不同时间点的TLR2/4、iNOS蛋白表达，明确AGEs刺激最佳时间为24 h，且在安全剂量范围内使用不同浓度PF预先干预AGEs刺激下的RAW264.7巨噬细胞，我们发现最合适的PF干预浓度为10-5 mol·L-1，故以此作为后续实验中的PF干预浓度，并使用TLR2/4抑制剂作为阳性对照。进一步研究发现，与AGEs组相比，PF明显抑制TLR2/4信号通路的激活及相应炎症因子的表达，提示PF可能通过干预TLR2/4信号通路，抑制RAW264.7巨噬细胞激活，进而保护DN。
综上所述，本研究结果初步证实AGEs能诱导RAW264.7巨噬细胞活化，而PF可明显下调AGEs诱导产生的效应，其机制可能与抑制TLR2/4信号通路有关，这为DN的治疗提供理论基础。但PF的抗炎作用除抑制TLR2/4通路外，还可能与其影响其他调控炎症因子表达的途径有关，这些炎症通路间是否有一定的交互调控，仍待进一步的实验探究。
( 致谢: 本实验于安徽医科大学第一附属医院肾内科实验室完成，实验过程中孟晓明教授给予悉心指导与大力支持，在此表示衷心的感谢。 )
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