2. 大理大学基础医学院病理学教研室，云南 大理 671000
2. Dept of Pathology, Basic Medical Science School of Dali University, Dali Yunnan 671000, China
心脑血管疾病由于其高发病率、高致残率和高死亡率，严重威胁着人类的生存质量和期望寿命。目前，已超过肿瘤成为人类的第一大致死原因。流行病学研究发现，孕期子宫内环境不佳，可致胎儿生长受损，并与心血管疾病的发生密切相关[1-2]。高血压是造成心脑血管疾病最主要的因素之一，但其病因迄今未明。因此，进一步探讨高血压的发病机制，将其发病因素追溯至孕期，寻找新的防治靶点，对于改善高血压的防治水平，从而有效降低心脑血管事件的发生具有重要意义。
本实验室前期研究发现，于大鼠孕期给予炎症刺激剂脂多糖 (lipopolysaccharides，LPS) 或酵母多糖刺激，子代大鼠从6周龄开始血压升高，随着鼠龄增加，血压不断升高，至24周龄达高血压标准；子代大鼠体重增加、脂肪重量异常等[3-4]。在小鼠中的研究也表明，孕期炎症刺激可致子代小鼠脂肪发育异常，影响其脂质代谢[5]。同时，出现血管反应性异常，局部肾素血管紧张素改变及肾损伤等[6-7]。针对孕期炎症刺激对于子代大鼠血管结构的影响，本课题组前期研究发现孕期给予LPS刺激后，子代大鼠从新生儿期，即出生1 d至1周，血管即出现损伤[8]。然而，孕期刺激后，子代大鼠6周龄血压开始升高时的血管结构是如何改变，尚未见报道。因此，本研究在前期研究的基础上，观察了孕期LPS刺激后，子代大鼠6周龄时胸主动脉结构的改变，以期对孕期炎症刺激致子代高血压的机制做进一步的研究。
1 材料与方法 1.1 动物、试剂与仪器清洁级SD孕鼠购于第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心。总RNA提取试剂盒 (离心柱型)(TIANGEN)；逆转录试剂盒及扩增试剂盒 (TaKaRa)；脂多糖 (Sigma)；二硫代氨基四氢呋喃 (PDTC)(Sigma)；氯化钠注射液 (太极西南药业股份有限公司)；化学发光试剂 (Millipore)；显影液及定影液 (柯达)；抗体：Cx37(Abcam，ab101928；Santa Cruz，sc-27716)、Cx40(Abcam，ab101929；Santa Cruz，sc-20466)、Cx43(Abcam，ab11370)、Cx45(Abcam)、GAPDH (Cell Signing Technology)、β-actin (Santa Cruz)、山羊抗小鼠IgG-HRP (Santa Cruz)、山羊抗兔IgG-HRP (中杉金桥)。荧光定量PCR仪/Relplex (Epqradient)；ND-2000微量核酸定量仪，NANO DRDP 2000(Thermo)；低温离心机，H1650-W (Sigma)；正置显微镜，E-100(Nikon)；垂直电泳仪、转膜仪等 (BIO-RAD)。与透射电镜及激光共聚焦相关的试剂及仪器均由第三军医大学中心实验室提供。
1.2 实验动物分组及处理12只孕鼠随机分为3组：对照组 (Con)、LPS刺激组 (LPS)、LPS刺激加PDTC干预组 (L+P)。Con组在孕d 8~14每天腹腔注射生理盐水0.5 mL；LPS组在孕d 8、10、12腹腔注射LPS (0.79 mg·kg-1)，d 8~14每天注射生理盐水0.5 mL；L+P组在孕d 8、10、12注射LPS，同时d 8~14注射PDTC (100 mg·kg-1)。出生6周龄时称体质量，各组随机处死8只仔鼠，取主动脉弓至胸主动脉分叉处进行后续实验。
1.3 子代大鼠胸主动脉超微结构观察主动脉弓段在戊二醛中切成小段 (0.2~0.3 cm) 固定过夜，脱水、包埋、超薄切片、染色后在透射电镜下观察其超微结构。
1.4 胸主动脉Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的mRNA含量检测取胸主动脉段至分叉处组织，进行RNA提取、逆转录、实时荧光定量PCR检测。用β-actin作为内参基因，采用2-ΔΔCt法进行计算。引物序列均由上海生工生物工程公司合成、纯化 (Tab 1)。
| Gene | Primer sequences (5′-3′) | Sequence length/bp | |
| β-actin | 1 | ACGGTCAGGTCATCACTATCG | 155 |
| 2 | GGCATAGAGGTCTTTACGGATG | ||
| Connexin37 | 1 | CATCCGATACTGGGTGCTGC | 84 |
| 2 | CGCCGAGACAGGTAAATGACG | ||
| Connexin40 | 1 | GAAAGAGGTGAACGGGAAGA | 237 |
| 2 | GCCACAGCCATCATAAAGACA | ||
| Connexin43 | 1 | GACATGGGTGACTGGAGTG | 174 |
| 2 | TTGAGTGTTACAGCGAAAGG | ||
| Connexin45 | 1 | GAGATGGAGTTAGAAAGCGAGAA | 168 |
| 2 | CAGGAAATACTGCCCTATGAGA |
胸主动脉提取蛋白，采用Western blot检测Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的蛋白表达水平 (Cx37、Cx40及Cx43蛋白检测采用GAPDH作为内参蛋白；Cx45检测采用β-actin作为内参蛋白)。凝胶分析系统Quantity One计算条带光密度。
1.6 胸主动脉Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的免疫荧光检测降主动脉段OCT包埋，冰冻切片，固定，封闭、一抗孵育、Cy5二抗孵育、DAPI工作液染核，封片，激光共聚焦显微镜下观察各组Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的免疫荧光表达情况。
1.7 统计学处理用SPSS 13.0软件包进行统计分析，所有实验数据用x±s表示。组间比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 子鼠出生情况见参考文献[8]。
2.2 子代大鼠6周时体质量情况LPS组子代大鼠在6周时♂♀体质量均明显高于对照组[分别为 (107.062±14.470) g比 (57.262±9.817) g，(100.15±13.104) g比 (68.325±19.056) g, P＜0.01，n=8]，L+P组♂鼠[(89.557±15.756) g]明显低于LPS组 (P＜0.05)，而♀鼠[(103.45±16.912) g]无差异 (n=8)。
2.3 子代大鼠6周时胸主动脉超微结构如Fig 1所示，子代大鼠在出生第6周时，Con组内皮层未见损伤，内皮细胞 (endothelial cell，EC) 形态完整，内弹力膜完整，平滑肌层细胞 (vascular smooth muscle cell，VSMC) 排列整齐，胞核形态规则，平滑肌层弹性纤维及胶原纤维连续完整，各细胞器正常，EC间可见膜通道结构的GJ (Fig 1A、1B)；LPS组内皮层受损，EC见大量破裂，内弹力膜断裂，VSMC排列相对紊乱，胞核形态不规则，明显向内皮层生长，EC间明显可见GJ，相对于Con组较长且多见 (Fig 1C、1D)；L+P组内皮损伤程度较LPS组稍有改善，VSMC排列紊乱，EC间可见GJ (Fig 1E、1F)。
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| Fig 1 Representative transmission electron micrographs of aortas in 6-week offspring A, B:Con group; C, D:LPS group; E, F:L+P group.EC:endothelial cell, SMC: smooth muscle cell, IE: internal elastic lamina, GJ: gap junction, L: lumen |
如Fig 2所示，子代大鼠6周时，♀♂间胸主动脉Cx mRNA的表达无差异。LPS组Cx43的mRNA表达明显比Con组降低 (P＜0.05)；L+P组Cx43的mRNA表达明显比LPS组增加 (P＜0.05)。各组间Cx37、Cx40及Cx45的mRNA表达差异没有统计学意义。
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| Fig 2 mRNA expression of connexin in 6-week offspring aorta (x±s, n=7) *P < 0.05 vs Con; #P < 0.05 vs LPS |
如Fig 3~6所示，LPS组胸主动脉Cx43的蛋白表达比Con组明显降低 (P＜0.05)；L+P组Cx43的蛋白表达比LPS组明显升高 (P＜0.05)。各组间Cx37、Cx40、Cx45的蛋白表达差异没有统计学意义。
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| Fig 3 Protein expression of Cx37 in 6-week offspring aorta (x±s, n=8) |
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| Fig 4 Protein expression of Cx40 in 6-week offspring aorta (x±s, n=8) |
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| Fig 5 Protein expression of Cx43 in 6-week offspring aorta (x±s, n=8) *P < 0.05 vs Con; #P < 0.05 vs LPS |
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| Fig 6 Protein expression of Cx45 in 6-week offspring aorta (x±s, n=8) |
如Fig 7所示，Cx37和Cx40主要在血管内皮表达，Cx43和Cx45主要在平滑肌层中大量表达。♀鼠与♂鼠的胸主动脉Cx37、Cx40、Cx43和Cx45免疫荧光结果并无明显差别。LPS组的Cx43荧光强度及荧光点数明显比Con组降低；L+P组Cx43的荧光强度及荧光点数明显比LPS组增高。各组间Cx37、Cx40和Cx45的荧光强度和荧光数量并无明显差异。
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| Fig 7 Immunolabeling of connexin in 6-week offspring aorta (scale:25 μm) |
有研究表明[9]，动脉壁结构变化所致的大动脉顺应性降低，是心脑血管疾病发生发展的独立危险因素，高血压大鼠主动脉中出现血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ) 受体AT1、AT2表达改变等[10]，这些均说明，大动脉的病变对于高血压的发生发展具有重要的意义。本研究结果表明，孕期LPS刺激子代大鼠在6周龄时胸主动脉出现内皮损伤，内弹力膜断裂，VSMC明显向内膜生长等病理改变，这些病变可能是继新生儿期血管病变后的持续病变，其所致的血管壁增厚、血管紧张度改变等，可能是其在6周龄即出现血压升高的关键，也是高血压维持和发展的结构基础。至子鼠12周龄，内皮损伤越发严重，VSMC增殖、迁移更为明显，血管反应性异常[11]。孕期LPS刺激后，从大鼠出生后的持续的血管病变，可能是子代大鼠高血压发生的重要原因。
本实验室前期研究表明，孕期LPS刺激致子代发生高血压与血管及肾脏局部肾素血管紧张素系统 (renin angiotensin system，RAS) 异常激活相关，孕期LPS刺激同时给予核转录因子κB (nuclear factor kappa B，NF-κB) 特异性抑制剂PDTC能逆转子代血压的升高，改善血管的功能[6-7, 12-13]；最新研究亦表明孕期炎症刺激所致的NF-κB的调节紊乱，可作用于RAS系统的异常激活，也是子代高血压发病的机制之一[14]。连接血管细胞之间的连接通道排列而成一种特殊膜结构，称之为缝隙连接 (GJ)，其由细胞膜上的连接子相互衔接而成，每个连接子由6个Cx组成。组成同一个连接子的Cx可同可不同，因而使连接子所形成的连接通道具有不同的通透性和选择性。大动脉中常见的连接蛋白为Cx37、Cx40、Cx43及Cx45。小鼠的基因敲除实验证实了GJ与血压调节存在着一定联系[15]，Cx的表达与高血压的关系，可能是其参与了肾素及对内皮一氧化氮合酶 (endothelium NO synthase，eNOS) 的调节[16-17]，不同类型的高血压模型中，主动脉Cx受到不同的调节，表达变化不一致，这说明不同的Cx可能具有共同或独特的功能[18]。前期研究发现[8]，孕期炎症刺激后，子代大鼠在新生儿期就出现Cx的异常变化，但在子代大鼠6周龄，即血压开始升高时，Cx的变化如何，尚未见报道。本研究结果提示，孕期LPS刺激后，子代大鼠在6周龄时其胸主动脉内皮细胞间的GJ较对照组多且长，平滑肌细胞之间及异型细胞之间的GJ少见；同时，Cx43的mRNA及蛋白表达明显降低，而Cx37、Cx40及Cx45的mRNA及蛋白表达无明显改变；孕期LPS刺激同时给予PDTC干预可明显增加子代大鼠6周龄时Cx43的mRNA及蛋白表达量。Cx43对于压力改变较为敏感，在血管壁中含量最为丰富，Cx43通道所调节的细胞间信号交流可参与血管壁弹性的调节，从而影响高血压的发生发展，在不同的高血压模型中，Cx43的表达有差异[19]；Cx基因敲除小鼠外周血中Ang Ⅱ含量明显增加，Cx43表达升高可有效降低自发性高血压大鼠的血压[20]。我们的研究发现，孕期LPS刺激后，从新生儿期开始，子代大鼠随着鼠龄的增加，血管损伤进一步加重，血压升高，Cx的mRNA及蛋白表达呈现出不同的变化格局[8, 11](部分数据未列出)。因此，有理由推测Cx表达改变是孕期LPS刺激后，其子代大鼠维持血管稳态的适应性反应，主动脉缝隙连接的异常及Cx43表达的异常与其血管的损伤密切相关。Alonso等[21]研究发现，Cx43在高血压中表达异常，可能与Ang Ⅱ及NF-κB的异常调节有关，NF-κB能直接并特异地与编码Cx43的Gja1基因的启动子位点结合，从而直接调节Cx43的表达。本实验用NF-κB特异性抑制剂PDTC干预后，可逆转Cx43的异常表达，因此我们推测孕期炎症刺激致子代大鼠6周龄时Cx43的异常表达可能受血管组织中NF-κB的调节。
综上所述，孕期炎症刺激致子代大鼠6周龄时血管结构的损伤，是继新生儿期就开始的损伤的持续性变化；是子代大鼠6周龄即出现血压异常的结构基础，也可能是其成年大鼠高血压发生的关键因素。
( 致谢: 本实验老鼠模型建立、RT-PCR、WB等相关实验在第三军医大学药学系药物研究所完成；免疫荧光实验及透射电镜实验在第三军医大学中心实验室完成。感谢中心实验室老师对激光共聚焦及透射电镜的技术指导。 )
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