2. 山西医科大学 第一医院内分泌科，山西 太原 030001
2. Dept of Endocrinology of the First Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
多巴胺 (dopamine, DA) 是一种主要由大脑分泌的神经传递物质，负责控制人的运动、情绪与感觉，并将兴奋信息上传，与精神和神经系统方面的疾病密切相关[1]。研究表明[2]，在外周组织如肾脏、胰腺和上消化道中也可以合成并释放多巴胺，调节非神经系统的功能。由于外周多巴胺无法穿过血脑屏障，不会影响到神经系统的功能，但是它可以在其合成的组织中发挥着旁分泌的作用。近年来，多巴胺与胰岛素之间的关系受到越来越多的关注。临床发现长期使用多巴胺的前体左旋多巴治疗帕金森疾病，这些病人通过口服糖耐量实验发现糖的耐受力明显下降，这种现象在帕金森患病人群中高达50%~80%[3]。多巴胺被认为可以影响胰岛素的分泌[4]，然而其作用机制尚不明晰。本研究拟通过胰岛素分泌实验以及膜片钳、钙成像技术，探究多巴胺对胰岛素分泌的作用及可能机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物SD大鼠, ♂, 由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，体质量180~250 g。生产许可证号：SCXK-(军)2012-0004。
1.2 试剂Dopamine hydrochloride (美国Sigma，批号：BCBG8676V)；胶原酶P (瑞士Roche，批号：11104222)；BSA (北京索莱宝，批号：83100513)；RPMI 1640培养基 (上海生工，批号：C518FA0002)；胎牛血清 (上海生工，批号：B326FA0092)；青、链霉素 (北京索莱宝，批号：20150909)；HEPES (北京索莱宝，批号：710B048)；Histopaque 1077(美国Sigma，批号：RNBF1783)；DispaseⅡ(美国Amresco，批号：10888700)；D-葡萄糖 (北京索莱宝，批号：405A0918)；胰岛素检测试剂盒 (北京北方生物技术研究所，批号：20160320)。
1.3 仪器电子天平 (上海精密仪器，型号：GB/T26497)；体式显微镜 (上海中恒仪器, 型号：SM262)；倒置显微镜 (日本OLYMPUS, 型号：AE-2000)；台式离心机 (长沙湘仪仪器, 型号：SC-3610)；细胞培养箱 (北京博奥恒信生物科技, 型号：HF100)；Narishige MODEL PP-830电极拉制仪 (日本Narishige, 型号：PP-830)；MIRO FORGE MF-830抛光仪 (日本Narishige, 型号：MF-200)；EPC10全自动膜片钳 (德国HEKA, 型号：MP-285)；钙成像 (北京MDE, 型号：LAMBDA 10-B)。
1.4 方法 1.4.1 大鼠胰岛、胰岛细胞的分离与培养♂ SD大鼠断头处死后，将1 g·L-1胶原酶P溶液 (RPMI 1640培养基溶解) 缓慢注入到胆总管中, 分离的胰腺经37℃水浴消化、Histopaque 1077梯度离心得到单个胰岛，并放于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。分离胰岛细胞时，使用5 g·L-1的Dispase Ⅱ酶液消化胰岛，将细胞悬液均匀地接种在经细胞黏附剂处理过的玻片上，加入培养液后放于细胞培养箱中培养[5]。
1.4.2 胰岛素释放实验分得的单个胰岛经过夜修复后备用，每组7管，每管中放入5个胰岛。首先，使用2.8 mmol·L-1葡萄糖孵育液37℃孵育30 min, 弃除上清；然后，分别加入2.8 mmol·L-1和16.7 mmol·L-1葡萄糖孵育液以及含有不同浓度的DA孵育30 min, 收集上清液，采用放免法测得胰岛素含量；最后，加入乙醇粉碎胰岛，测得胰岛素的总含量。
1.4.3 膜片钳实验将分离的胰岛细胞置于倒置显微镜下，细胞膜电容>7 pF的为β细胞。记录电极经PP-830电极拉制仪两步法拉制，充满电极内液后电阻为4~7 MΩ, 当电极尖端与细胞膜之间形成高阻封接 (≥1 GΩ) 后，负压破膜，使电极内液与细胞内液相通，形成全细胞记录模式。记录电压门控性钙电流时，在-70 mV钳制电压下给予-50 mV~30 mV的电压刺激，记录50 ms内每次递增10 mV的钙电流。记录动作电位采用电流钳模式，封接破膜后，给予150 pA、4 ms的电流注入，计算从去极化开始到复极化于静息电位之上10 mV的时程为动作电位时程[6]。
1.4.4 钙成像实验细胞在37℃的环境下用2 μmol·L-1的Fura-2AM荧光探针染料染色约30 min。然后将细胞放置于激光共聚焦显微镜上，设定激发波长为340 nm/380 nm，发射波长为510 nm。以持续灌流的方式给予2.8 mmol·L-1葡萄糖 (2.8 G)、16.7 mmol·L-1葡萄糖 (16.7 G) 和10 μmol·L-1 DA (以16.7 G溶解)，F340/F380的比值反映灌流液体对细胞内钙离子浓度的影响。该实验在30℃环境中进行。
1.4.5 统计学处理实验数据用x±s表示, 采用Sigmaplot12.0软件分析，t-text方法进行检验。膜片钳数据用Pulsefit软件分析。
2 结果 2.1 DA对大鼠胰岛素分泌的影响在2.8 mmol·L-1葡萄糖 (2.8 G) 和16.7 mmol·L-1葡萄糖 (16.7 G) 的基础上分别加入不同浓度的DA (0、1、10 mmol·L-1)，孵育30 min后，检测上清液中胰岛素的含量。Tab 1结果显示，在2.8 G的条件下，DA对胰岛素的分泌没有产生明显的影响；在16.7 G的条件下，DA呈浓度依赖性抑制胰岛素的分泌 (P＜0.01)。
| Glucose concentration/mmol·L-1 | Dopamine/μmol·L-1 | ||
| 0 | 1 | 10 | |
| 2.8G | 12.498±3.056 | 14.184±2.548 | 9.042±1.181 |
| 16.7 G | 158.588±9.721## | 91.154±5.528* | 45.930±6.706** |
| ##P＜0.01 vs 2.8 G (DA 0 μmol·L-1); *P＜0.05, **P＜0.01 vs 16.7 G (DA 0 μmol·L-1) | |||
通过电压钳技术，在-70 mV的钳制电压下给予-50 mV~30 mV的电压刺激50 ms，每次递增10 mV检测胰岛β细胞上钙电流。与对照组相比，DA (10 μmol·L-1) 明显地抑制了钙电流[0 mV时，对照组 (-3.963±0.406) pA/pF, DA组 (-2.344±0.429) pA/pF, P＜0.01]。见Fig 1。
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| Fig 1 Effect of DA on voltage-gated calcium channels A, B: Representative current traces recorded under the different treatment as indicated; C: Summary of the mean current density of Ca2+ currents at 0 mV (n=6).**P < 0.01 vs control |
通过电流钳技术，给予细胞150 pA、4 ms的电流注入，检测给药前后动作电位时程的变化。与对照组相比，DA (10 μmol·L-1) 明显地缩短了动作电位的时程 (P＜0.01)。见Tab 2。
| Group | Action potential duration/ms |
| Control | 59.578±4.493 |
| Treatment with DA | 32.968±3.166** |
| **P＜0.01 vs control | |
细胞在37℃的环境下使用2 μmol·L-1的Fura-2AM孵育约30 min，然后放置于340 nm/380 nm激发波长，510 nm发射波长下，测得DA对细胞内Ca2+浓度的影响。Fig 2结果显示，DA使细胞内Ca2+浓度减少。以灌流初始值 (F0) 标化后结果如下：2.8 G (0.036±0.001)，8.3 G (0.631±0.033)，DA (0.482±0.034)。
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| Fig 2 Effect of DA on level of intracellular Ca2+ concentration A: The trace shows the changes of intracellular Ca2+ concentration in a representative cell perfused with 2.8, 16.7 and 16.7 G+DA (10 μmol·L-1); B:The mean value of ΔF340/F380(Fmax-F0) in response to different treatments as indicated (n=6).##P＜0.01 vs 16.7G; **P＜0.01 vs 2.8G. The change of intracellular calcium[ΔF340/F380(Fmax-F0)] was determined by subtracting the initial F340/F380 ratio from the maximum F340/F380 for each treatment |
在生理条件下，葡萄糖是影响胰岛素释放最主要的因素。葡萄糖通过主动转运的方式进入细胞内部后，经过糖酵解和氧化磷酸化生成ATP，ATP使细胞膜上的ATP敏感性钾通道 (KATP) 关闭，细胞膜去极化，达到一定程度后，电压依赖性钙通道开放，外钙内流，细胞内钙离子浓度升高，使成熟的分泌囊泡附着于微管微丝上，并通过两者的相互作用促进囊泡膜与细胞膜融合，最终诱导胰岛素的释放[7-8]。除此之外，外周的多种配体也发挥着重要的调节作用，如血管活性肠肽 (VIP)、胰高血糖素样肽 (GLP-1)、乙酰胆碱 (Ach) 等。有数据显示，多巴胺作为一个生理因子可以与β细胞上的多巴胺受体结合调节细胞的分泌活动[2, 7, 9]，外周多巴胺的异常会影响胰岛素的正常调节。帕金森患者在治疗过程中，通常使用左旋多巴和苄丝肼以提高中枢神经系统中多巴胺的浓度，并阻止外周左旋多巴转换为多巴胺给机体带来负面影响[10]，但在这一过程中仍然会有部分的多巴胺进入到外周[2]，抑制葡萄糖刺激胰岛素的分泌活动，给胰岛功能造成慢性的压力，使得帕金森患者中糖耐量异常现象较为普遍[3, 10]。因此，了解外周配体，尤其是多巴胺对于调节胰岛素释放的机制变得越来越重要。现今的文献报道中，关于多巴胺对胰岛素分泌的影响存在着争议，有部分学者认为多巴胺及其类似物可以抑制葡萄糖刺激胰岛素分泌，而少部分认为急性多巴胺的大量累积可以促进胰岛素的分泌[9]。在本实验中，我们发现DA在16.7 G的基础上明显地抑制了胰岛素的分泌，而在2.8 G的基础上对胰岛素的分泌活动影响较小。电压-电流曲线关系表明，DA抑制了电压门控性钙通道的开放，减小了钙电流。通过给予150 pA、4 ms的电流注入，观察细胞动作电位时程的变化，结果表明，DA通过抑制钙电流，加快动作电位的复极化，明显缩短了动作电位的时程。DA干预后，细胞内钙离子浓度降低，这可能与电压门控性钙通道被抑制有关。
我们推测，DA可能是通过抑制了钙通道影响了胰岛素的分泌。由于β细胞的动作电位主要是由Ca2+通道和K+通道来产生的，是动作电位去极化和复极化的主要离子通道，而动作电位又可以直接调节胰岛素的分泌活动。本次实验证实了DA抑制了电压门控性Ca2+通道，使得动作电位去极化幅度降低，复极增快，动作电位时程缩短，细胞的兴奋性下降；同时也使细胞内Ca2+浓度下降，分泌囊泡与细胞膜融合缺乏动力，影响了囊泡的胞吐活动，最终抑制了胰岛素的分泌活动。但关于K+通道是否也参与其中仍待进一步的研究。
( 致谢: 本文实验在山西医科大学药理教研室章毅实验室完成，在此对实验人员表示感谢。 )
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