肿瘤的发生、发展、转移及复发都与肿瘤新生血管密切相关，因此，抗血管生成疗法已成为肿瘤治疗的一种重要手段[1-2]。血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 是特异性最强的一种血管生长因子，VEGF特异性抑制剂Avastin等抗血管治疗药物作为肿瘤临床治疗的辅助用药显示了良好的治疗效果，但因其半衰期短、价格昂贵以及非人源化单克隆抗体应用时会出现的人抗鼠抗体反应 (human anti-mouse antibody reaction, HAMA reaction) 等缺陷，限制了其在临床上的应用。
主动免疫的方法可以通过依靠自身机体产生特异性的抗VEGF免疫反应，抑制肿瘤血管的生成，达到抗肿瘤目的。但是，在胚胎发育初期机体已对VEGF产生免疫耐受，免疫原性较弱，难以诱导有效的免疫应答[3]。针对VEGF免疫原性较弱的特点，我们前期将破伤风毒素2个强T细胞辅助表位618~627位肽段和831~838位肽段替换hVEGF121的1~8位和115~121位2个肽段，构建了hVEGF121突变体I，并在突变体Ⅰ的基础上，通过加端PCR方法将热休克蛋白mHSP70分子中具有免疫激活调节作用的407~426片段串联2次，以柔性肽连接于hVEGF121突变体Ⅰ的C末端，构建了hVEGF121突变体Ⅱ。实验证实，hVEGF121突变体Ⅱ蛋白疫苗激发机体产生了较强的针对VEGF的免疫应答，显示了一定的抗肿瘤作用[4-5]。
临床上，血管生成抑制剂主要用于与化疗联合的肿瘤综合治疗方案，但关于主动治疗的VEGF蛋白疫苗与化疗联用的报道仍较少。在本实验中，我们选用肝癌的一线化疗药物环磷酰胺 (cyclophosphamide, CTX) 作为研究对象，进一步考察hVEGF121突变体Ⅱ蛋白疫苗与低剂量CTX联用能否产生抗肿瘤协同增效的作用，并初步研究该协同增效的作用机制，期望可以为VEGF蛋白疫苗的进一步临床开发提供基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物与细胞株♂ BALB/c小鼠，4~5周龄，由第四军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK-(军)2012-007；小鼠H22肝癌细胞购自中国科学院上海细胞所，在本实验室培养保存。
1.1.2 试剂环磷酰胺注射液，由江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号：国药准字H32020857；RPMI 1640培养基，购自美国Hyclone公司；细胞培养用胎牛血清，购自杭州四季青生物工程材料研究所；细胞培养用青霉素链霉素混合液、TMB单组份显色液，购自北京索莱宝科技有限公司；辣根过氧化物酶 (HRP) 标记兔抗小鼠IgG抗体、DAB显色试剂盒，购自北京中杉金桥生物科技有限公司；其他试剂均为市售。
1.2 方法 1.2.1 H22皮下移植瘤模型建立将24只4~5周龄的♂ BALB/c小鼠适应性喂养1周后，随机分成4组，每组6只，分别为PBS空白对照组、环磷酰胺组 (CTX)、hVEGF121突变体Ⅱ疫苗组 (V2) 和环磷酰胺与hVEGF121突变体Ⅱ疫苗联合 (V2+CTX) 组。调整H22肝癌细胞浓度为1×1010·L-1，每只小鼠右肋皮下接种100 μL肿瘤细胞悬液，建立H22肝癌皮下移植瘤模型。
1.2.2 治疗性免疫策略分别于接种肿瘤后的d 2、6、12，V2组及V2+CTX组每只小鼠左肋皮下免疫V2疫苗100 μL，剂量为0.5 g·L-1；CTX组及V2+CTX组腹腔注射CTX 100 μL，剂量为30 mg·kg-1，空白对照组注射等量PBS。成瘤后，隔天测量肿瘤大小，按公式V=0.52×长径×短径2计算肿瘤体积；接种肿瘤后的d 15处死所有小鼠，剥取肿瘤，测量瘤重并拍照，并对肿瘤组织切片进行HE染色，处死前眼眦静脉丛取血分离各组小鼠血清，-80℃保存备用。
1.2.3 酶联免疫吸附法 (ELISA) 对免疫血清抗VEGF抗体水平检测用纯化的VEGF融合蛋白为抗原，将其溶解在碳酸盐缓冲液中，每孔100 μL，4℃过夜包被96孔酶标板。每孔加1 :50倍稀释的小鼠免疫血清，37℃孵育2 h，PBST洗涤后，加1 :100 000倍稀释的HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体，TMB显色，酶标仪450 nm波长下检测吸光度值。
1.2.4 蛋白免疫印迹 (Western blot) 法对免疫血清抗VEGF抗体特异性检测将纯化的VEGF融合蛋白进行15%的SDS-PAGE分离。以1 :50倍稀释的小鼠免疫血清为一抗，以1 :10 000倍稀释的HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体为二抗进行Western blot，检测小鼠免疫血清中抗VEGF抗体的特异性。采用DAB显色试剂盒显色，对特异性条带进行分析。
1.2.5 皮内瘤血管生成模型建立将12只4~5周龄的♂ BALB/c小鼠适应性喂养1周后，随机分成4组，每组3只，分别为PBS空白对照组、CTX组、V2组以及V2+CTX组。按预防性免疫策略进行免疫，连续免疫4周，第4次免疫结束后接种皮内肿瘤。在接种皮内瘤的前1天，将各组小鼠腹部毛发刮去；每只小鼠皮内接种50 μL浓度为1×1010·L-1的H22肿瘤细胞悬液，建立皮内瘤血管生成模型。接种肿瘤细胞后，每天观察肿瘤生长情况，待瘤块鼓起约5~6 mm时，处死小鼠，剥离腹部外层皮肤，显微镜下观察瘤块附近的血管分布情况，包括主血管和分支血管，并计数。
1.2.6 安全性考察在治疗性动物实验过程中，对小鼠的饮食及日常行为进行检测，并称量体重。实验结束后，取各组小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，进行HE染色，200倍光学显微镜下观察是否对脏器有明显毒副作用。
1.3 统计学分析实验中所得数据采用Student′s t test检验，数据均用x±s表示。
2 结果 2.1 治疗性免疫中V2联合CTX协同抗肝癌增效作用如Fig 1所示，与PBS组相比，CTX组、V2组以及联合治疗组对皮下移植瘤均有一定的抑制作用 (P＜0.05)，其中联合治疗组抑制作用最明显，与V2组及CTX组差别均有显著性 (P＜0.05)。瘤重结果也显示，联合治疗组平均瘤重明显低于V2组及CTX组 (P＜0.05 vs V2, P＜0.01 vs CTX)。以上实验结果显示，环磷酰胺与融合蛋白V2疫苗联用可起到协同抗肿瘤增效作用。
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| Fig 1 Therapeutic antitumor effect induced by V2 and CTX in subcutaneous H22 hepatocellular carcinoma-bearing mice A: Schematic diagram of the immunization procedure; B: In vivo measurement of tumor growth; C: Subcutaneous tumor excised from mice; D: Weight of tumor from mice.*P < 0.05, **P < 0.01 vs CTX; #P < 0.05 vs V2 |
为了进一步确证联合治疗方案的抗肿瘤效果，我们对剖取的各组肿瘤进行HE染色观察。如Fig 2所示，PBS组肿瘤生长情况良好，细胞结构完整，血供较丰富，V2疫苗组、CTX组及联合治疗组均出现了不同程度的肿瘤组织坏死 (坏死区域如图中箭头所示)，其中联合组肿瘤坏死情况最明显，这进一步说明了联合治疗方案显示了最强的抗肿瘤作用。
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| Fig 2 Histopathology study of tumor tissues (×200) A:PBS; B:V2;C:CTX; D:V2+CTX |
为了考察化疗药CTX的引入能否抑制V2蛋白疫苗引起的抗-VEGF体液免疫应答，我们采用ELISA的方法检测了免疫小鼠血清中的抗-VEGF抗体产生情况。如Fig 3A所示，V2组及联合治疗组血清中的抗体水平较PBS组及CTX组明显升高 (P＜0.01)，而V2与CTX联合治疗组与V2组抗体水平相当，两者间差异并无显著性，这说明CTX的引入并不会对V2蛋白疫苗造成免疫抑制。
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| Fig 3 Detection of anti-VEGF humoral immune responses A: The level of specific anti-VEGF antibody; B: Western blot analysis of the specificity of anti-VEGF antibody. Lane 1: Prestained protein molecular marker; Lane 2: Target protein of VEGF.**P < 0.01 vs CTX. |
采用Western blot的方法确定小鼠免疫血清中所产生抗体的特异性。如Fig 3B所示，在第2泳道分子量为20 ku处出现一明显条带，此条带为抗VEGF抗体所产生的特异性条带，说明小鼠免疫血清中所产生抗体是VEGF的特异性抗体。
2.5 V2联合CTX抑制小鼠H22肝癌血管生成作用我们采用皮内肿瘤血管模型进一步考察了联合治疗方案对肿瘤新生血管的影响。与PBS相比，3个治疗组肿瘤周围血管数都有相应减少 (Fig 4)，其中联合治疗组对肿瘤新生血管的抑制作用最为明显，与单独的V2及CTX组相比，差异均有统计学意义 (P＜0.05 vs V2, P＜0.01 vs CTX)，这说明联合治疗方案产生了协同抗血管生成作用。
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| Fig 4 Effects of V2 and CTX on tumor induced angiogenesis A: Blood vessels around the intradermal tumor; B: Numbers of blood vessels around intradermal tumor.1: PBS; 2: V2; 3: CTX; 4. V2+CTX.**P < 0.01 vs CTX; #P < 0.05 vs V2 |
实验过程中，小鼠的饮食情况、日常行为及毛发特征未见明显变化，各组小鼠体质量也未见有明显差别。处死动物后，各组小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器表面均色泽鲜亮，无黏连等器质性变化，脏器HE染色结果也显示各组动物的脏器无明显组织病理学变化 (Fig 5)。
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| Fig 5 A general toxicity observation (HE staining, ×200) A: PBS; B: CTX; C: V2; D: V2+CTX |
目前，应用于临床的VEGF抑制剂主要为单克隆抗体和小分子受体抑制剂，但因其半衰期短需长期用药、毒副作用大、造价昂贵等缺点，限制了其在临床上的应用。主动免疫方式的疫苗可激发机体免疫系统产生持续的靶向肿瘤新生血管的免疫反应，避免了长期用药的缺陷，同时蛋白疫苗制备工艺简单，可规模化生产，能够大幅度降低患者的治疗成本[6]。
研究显示[7-10]，持续低剂量的化疗药物可增加抗血管生成药物对肿瘤微血管的靶向性，有效降低免疫抑制，与抗血管生成药物联用有协同增效的作用，抗血管生成药物也多被应用于肿瘤综合治疗方案中。我们前期研究中，开发了一种分子佐剂优化的重组VEGF蛋白疫苗，该疫苗在动物实验中显示了较好的抗肿瘤作用。在本实验中，为进一步研究该蛋白疫苗，我们将该分子佐剂优化的VEGF蛋白疫苗与低剂量化疗药CTX联用，拟考察两者联用能否产生联合增效作用。
实验结果显示，在抑制肿瘤生长和血管生成方面，V2疫苗与低剂量CTX存在协同增效作用。联合用药组小鼠肿瘤体积、瘤重均低于单一给药组，抑瘤率达到84.32%，明显优于单一给药组的78.80%(P＜0.05 vs V2) 和15.84%(P＜0.05 vs CTX)；同时，在皮内肿瘤血管模型中，联合组较各单药组更好地抑制了肿瘤新生血管的形成。安全性考察实验发现，联合治疗方案的毒副作用较单一给药组并没有明显增加, 实验小鼠的耐受性良好。本实验的结果证实，VEGF蛋白疫苗联合CTX治疗方案有应用于临床以延长肝癌患者生存时间的潜力，有潜在的开发价值。
( 致谢: 本文主要在滨州医学院新药技术开发中心实验室完成，在此对实验室各位老师和同学的帮助表示感谢！ )
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