2. 广东省疾病模式动物工程技术研究中心，广东 广州 510006
2. Disease Model Animal Engineering Technology Research Center of Guangdong Province, Guangzhou 510006, China
肾脏纤维化是糖尿病肾病 (diabetes nephropathy，DN) 的主要病理特征之一，肾小球系膜细胞过度增殖及纤维化在DN病程中起着关键作用[1-2]。DN的发病机制复杂，包括多元醇通路激活、氧化应激、炎症等，其中慢性炎症反应是DN公认的主要发病机制之一[3-5]。糖基化终末产物 (advanced glycation end products，AGEs) 在DN病程中发挥着重要作用。研究表明AGEs能够激活NF-κB信号通路，使肾小球系膜细胞 (glomerular mesangial cells, GMCs) 中细胞黏附分子 (intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)、纤维连接蛋白 (fibronectin，FN) 等炎症纤维化因子表达增加，从而参与糖尿病肾脏纤维化的病理进程[6]。
心肌素相关转录因子-A (myocardin related transcription factor-A，MRTF-A) 是转录调控激活辅助因子，MRTF-A能与含有MADS序列元件的转录因子如血清应答因子 (serum response factor，SRF) 结合，调控平滑肌细胞表型转化[7]。MRTF-A的激活受到RhoA/ROCK信号调控，后者在糖尿病及糖尿病肾病的调控作用均有大量报道[8-9]。研究表明，MRTF-A-/-小鼠在给予高糖高脂饮食或注射STZ后，相对于野生型小鼠，其糖耐量、胰岛素抵抗和微量白蛋白尿均有所改善[10]。然而AGEs诱导的糖尿病肾病的病理进程中，MRTF-A是否能够影响NF-κB信号通路，参与介导AGEs诱导的FN和ICAM-1的蛋白表达引起我们极大的兴趣。
据此，本研究观察了在AGEs诱导肾小球系膜细胞中，MRTF-A的变化及其对ICAM-1、FN等炎症纤维化因子的表达影响；探讨了MRTF-A对NF-κB信号通路的影响调节。结果证实：MRTF-A通过协同p65入核，参与介导了AGEs诱导GMCs的ICAM-1、FN等炎症纤维化因子的表达调节，在糖尿病肾脏纤维化发生、发展中可能具有重要的调节作用。
1 材料与方法 1.1 细胞的传代和培养大鼠肾小球系膜细胞根据已报道的方法进行原代培养并保存[11]，复苏后培养于DMEM培养基 (含10%胎牛血清) 中，置于37 ℃，5% CO2孵箱中培养，每2~3天传代，按目的进行实验。
1.2 实验试剂DMEM培养基 (Gibco)；PBS粉末 (武汉博士德公司)；BSA (无脂肪酸，MP)；D-葡萄糖 (Amresco)；蛋白酶抑制剂 (Pierce)；CCG-1423 (Santa Cruz)；识别ICAM-1、FN、MRTF-A、p65抗体 (Santa Cruz)；识别α-tubulin抗体 (Sigma)；识别Lamin-B抗体 (Abcam)；辣根过氧化物酶标记的二抗 (Promega)；核蛋白提取试剂盒 (active motif)；双人单面超净工作台 (苏州净化设备有限公司)；CO2培养箱 (Thermo)；电子分析天平 (Mettler-Toledo)。
1.3 AGEs制备以D-葡萄糖和牛血清白蛋白 (bovine serum albumin，BSA，无脂肪酸) 为原料制备AGEs。将0.8 g BSA与1.8 g葡萄糖溶于20 mL PBS (0.2 mol·L-1，pH 7.4)，充分混匀后用0.22 μm微孔滤膜除菌，密封，置于37 ℃避光孵育90 d。制备结束后，用10 mmol·L-1无菌PBS (pH 7.4) 透析96 h除去未结合的葡萄糖。对照组中不含葡萄糖，其他条件一致[12]。
1.4 质粒转染MRTF-A过表达质粒及空载购于Addgene。肾小球系膜细胞于孵箱培养24 h后开始转染实验。转染步骤按照Lipofectamine LTX & Plus Reagent说明书进行。转染24 h后，无血清培养基培养12~16 h，然后再改换含AGEs (100 mg·L-1) 的培养基培养24 h或1 h。
1.5 siRNA干扰实验MRTF-A siRNA构建于吉玛基因公司，序列如下：sense:5′-UGGAGCUGG UGGAGAAGAATT-3′；antisense: 5′-UUCUUCUCCACCAGCUCCATT-3′。细胞融合至40%~50%汇合度时开始转染。转染步骤按Lipofectamine RNAiMAX Reagent说明书进行。转染24 h后，无血清培养基培养12~16 h，然后再改换含AGEs (100 mg·L-1) 的培养基培养24 h或1 h。
1.6 Western blot免疫印迹细胞处理结束，根据核蛋白提取试剂盒说明书提取核蛋白或者用预冷的PBS漂洗3次，加入RIPA裂解液 (含1%蛋白酶抑制剂)，收集细胞裂解液于EP管中，冰上孵育，离心，取上清。进行BCA法蛋白定量，按上样量15 μg进行分装，沸水加热变性。然后进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后，将蛋白电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，将条带于对应的一抗溶液中4 ℃孵育过夜。次日，用对应的辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1 h，洗膜后于Image Quant LAS4000mini设备中进行显影。
1.7 统计分析用Graphpad Prism 5.0软件进行分析比较。多组间比较用单因素方差分析，两组组间比较、组内比较用t检验。
2 结果 2.1 MRTF-A在AGEs诱导的肾小球系膜细胞中表达增加我们首先观察AGEs对MRTF-A的表达影响。从Fig 1可以看出，在AGEs处理肾小球系膜细胞后，MRTF-A的蛋白水平呈时间和剂量依赖性增加。而等量的BSA对照对MRTF-A的蛋白无明显影响。为进一步实验提供基础。
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| Fig 1 Expression of MRTF-A in AGEs-induced GMCs *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
CCG-1423是RhoA/MRTF-A/SRF通路抑制剂，同时也能直接结合MRTF-A并抑制其入核[13]。CCG-1423 (工作浓度为1μmol·L-1) 预处理2 h后，更换AGEs处理24 h，如Fig 2结果显示，CCG-1423能明显抑制MRTF-A本身的蛋白表达，同时，与AGEs对照组相比，FN、ICAM-1的表达明显下调。
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| Fig 2 Effect of MRTF-A inhibitor CCG-1423 on FN and ICAM-1 expressions in AGEs-induced GMCs *P < 0.05 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs AGEs+DMSO |
如Fig 3结果所示，与正常对照组相比，AGEs组中的FN、ICAM-1和MRTF-A的表达增加。在此基础上过表达MRTF-A质粒，与空载对照相比，FN、ICAM-1和MRTF-A的表达得到进一步增加。因此，过表达MRTF-A能够进一步上调AGEs诱导的肾小球系膜细胞中FN和ICAM-1的表达。
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| Fig 3 Effects of MRTF-A overexpression on FN and ICAM-1 expressions in AGEs-induced GMCs *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs AGEs+Vector |
为了更加明确MRTF-A对FN、ICAM-1的作用，我们采用siRNA干扰MRTF-A。在明确干扰序列可用后，我们在AGEs条件下转染了干扰序列。Fig 4结果显示，与阴性对照组相比，干扰MRTF-A下调了AGEs诱导的肾小球系膜细胞中FN、ICAM-1的蛋白水平。综合Fig 3和Fig 4的结果，我们确定了MRTF-A参与介导AGEs诱导肾小球系膜细胞中的FN、ICAM-1表达。
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| Fig 4 Effects of MRTF-A knockdown on FN and ICAM-1 expressions in AGEs-induced GMCs *P < 0.05, **P < 0.01 vs control, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs AGEs+N.C |
许多研究发现，NF-κB作为与炎症密切相关的，普遍存在于真核细胞质中的快反应转录因子，参与了DN的发生、发展过程[14]。接下来我们通过过表达或干扰MRTF-A发现，过表达MRTF-A质粒进一步增加p65在细胞核内的水平，而干扰MRTF-A则能够减少p65在细胞核内的蛋白水平，如Fig 5所示。说明MRTF-A能够通过影响p65参与AGEs诱导肾小球系膜细胞中的ICAM-1、FN表达。
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| Fig 5 Effect of MRTF-A on NF-κB (p65) signaling in AGEs-induced GMCs *P < 0.05 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs AGEs+DMSO |
细胞外基质的过度积累是糖尿病肾病的主要病理改变之一。肾小球系膜细胞分泌的ECM积聚是促进肾小球基底膜增厚、肾小球硬化的主要机制之一，在DN的发生发展起到了重要作用[15]。AGEs是一组蛋白质、核酸和脂质通过非酶糖基化作用形成的一类大分子物质。AGEs可大量沉积在肾小球系膜、基底膜引起蛋白质的共价交联，破坏基质-基质和基质-细胞之间的相互作用[16]。大量研究表明，AGEs能引起细胞内活性氧增多，进而活化NF-κB及COX-2等炎症相关转录因子[17]，诱导GMCs中细胞黏附分子ICAM-1及纤维化因子FN、TGF-β的表达从而参与糖尿病肾脏炎症及纤维化的病理过程，但具体的分子机制尚待进一步阐明。我们在本研究中发现，MRTF-A参与介导了AGEs诱导的GMCs的FN、ICAM-1的形成，并进一步揭示MRTF-A是通过影响p65入核水平，参与调控FN、ICAM-1表达。
心肌素相关转录因子MRTF-A由于其广泛的作用，是目前研究最多的MRTFs家族成员。虽然文献已经报道了MRTF-A与DN的关系，但是MRTF-A与AGEs诱导FN、ICAM-1表达增加以促进DN之间关系的还不清楚，同时，也未在其他模型或器官中有关于MRTF-A与AGEs两者间关系的报道。我们的实验结果表明：在AGEs处理的肾小球系膜细胞中，MRTF-A的表达与正常相比明显升高。通过干扰或抑制MRTF-A能够下调AGEs诱导GMCs中FN、ICAM-1表达，而过表达MRTF-A则能进一步上调AGEs诱导GMCs中FN、ICAM-1表达。提示在AGEs诱导肾小球系膜细胞FN、ICAM-1等炎症纤维化因子的表达增加效应中MRTF-A发挥了重要的参与介导作用。
NF-κB及其介导的炎症反应是DN发生发展的重要因素。研究表明[18]，在oxLDL诱导的内皮细胞中，p65能够与MRTF-A相互作用并招募其入核，共同参与ICAM-1的转录，这提示了在肾小球系膜细胞中，MRTF-A与p65之间有可能存在联系。本研究中通过干扰或过表达MRTF-A观察了p65在细胞核内的蛋白水平变化，进一步探讨了MRTF-A参与DN的机制。为将MRTF-A作为抑制糖尿病肾脏纤维化、抗糖尿病肾病的潜在靶点提供了初步的实验依据。
( 致谢: 本实验于中山大学药学院药理毒理实验室完成，感谢黄河清教授指导，感谢陈诚的前期实验工作，感谢陈志泉、黄佳妮的参与。 )
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