2. 南昌大学研究生院医学部，江西 南昌 330006;
3. 九江学院基础医学院生化教研室，江西 九江 332000
2. Medical Graduate School of Nanchang University, Nanchang 330006, China;
3. Dept of Biochemistry, School of Basic Medicine of Jiujiang College, Jiujiang Jiangxi 332000, China
骨缺损临床上常见，治疗起来比较棘手，经济花费多，常出现骨不连、骨不愈合、畸形、功能障碍等。随着人口老龄化、高能量暴力损伤逐年增多，大段骨缺损发生率也不断上升。骨组织工程技术治疗大段骨缺损是一种崭新的方法，试图减少骨缺损治疗并发症及经济费用，具有一定的应用价值。生长诱导因子是骨组织工程中的因素之一，在骨修复过程中起到至关重要的作用。一些外源性成骨生长诱导因子已应用于临床来促进骨修复，但其价格昂贵，剂量难以控制，长期大量应用可产生一定的毒副作用，使得其广泛应用受到一定约束。近年来研究发现，一些传统中药具有一定促成骨分化潜能，可替代外源性成骨生长诱导因子或作为补充[1]。
刺头复叶耳蕨 (arachniodes exilis) 为鳞毛蕨科复叶耳蕨属植物，多年来，作为一种民间用药，用于治疗急性黄疸型肝炎、腰腿疼、关节炎、烧伤等，已被证明具有抗菌及抗炎作用[2]。Zhou等[3]研究发现，刺头复叶耳蕨的乙醇提取物具有潜在的抗氧化和护肝作用，在治疗肝脏疾病方面具有一定的潜能。刺头复叶耳蕨提取物成分复杂，各种提取物的生物学作用尚不清楚，其中黄酮及多酚类衍生提取物研究颇多，具有一定的价值。Li等[4]研究发现，刺头复叶耳蕨提取物总黄酮能通过活化MAPK信号通路介导肝癌HepG2细胞凋亡，而对正常人肝LO2细胞增殖影响较小，特别是在低浓度时。Wu等[1]研究报道黄酮类化合物淫羊藿能够促进BMSCs成骨分化。Song等[5]研究证实淫羊藿促进MC3T3-E1细胞增殖，并能够通过雌激素受体 (ER) 介导激活ERK及JNK信号途径，促进成骨分化。本研究探讨TFAE对hUCMSCs增殖及成骨分化的作用，为药物的开发利用及骨缺损的治疗提供实验参考。
1 材料 1.1 脐带人脐带由九江市妇幼保健院提供，产妇及胎儿健康。产妇及家属对本研究知情同意, 并经医院伦理委员会批准。
1.2 主要试剂TFAE由九江学院药学院提供 (采用超声辅助的乙醇浸提法及聚酰胺纯化提取，芦丁样结构化合物含量为75%)，α-MEM培养基、Hyclone胎牛血清 (Hyclone公司美国)，CCK-8细胞增殖检测试剂盒 (上海经科化学)，ALP测定试剂盒 (上海荣盛生物)，hUCMSCs成骨诱导分化培养基试剂盒、茜素红染色液 (广州赛业生物科技)，GREENspin组织/细胞RNA提取试剂盒 (北京庄盟)，HiFiscriptcDNA第一链合成试剂盒、Goat Anti-Rabbit IgG、HRP (北京康为世纪)，基因引物 (上海生工生物工程)，2×Tap Master Mix (上海近岸)，总蛋白提取试剂盒 (北京普利莱)，兔抗人GAPDH、Col1a1、OPN多克隆抗体 (Abcam美国)。
1.3 主要仪器倒置荧光显微镜 (Nikon日本)，酶标仪 (Bio-Tek美国)，PCR仪 (杭州博日科技有限公司)，SIM凝胶成像系统 (SIM公司美国)，电泳仪 (Bio-RAD美国)。
2 方法 2.1 hUCMSCs分离、培养本研究团队已建立了hUCMSCs分离、培养及纯化、鉴定的实验研究条件[6]。无菌条件下分离脐带中的华通氏胶，将其剪成体积约3~5 mm3大小，接种于10 cm2塑料皿中，加入含10%胎牛血清的α-MEM培养基，置于37℃，5% CO2培养箱中培养，3 d更换一次培养基。待细胞融合达80%~90%后，消化接种于25 cm2培养瓶中，细胞融合达80%~90%后，按1:3传代培养，取P3代进行实验，倒置相差显微镜观察细胞形态。
2.2 CCK-8法检测细胞活性实验分为5组：0 mg·L-1 TFAE组 (对照组)，1 mg·L-1 TFAE组，5 mg·L-1 TFAE组，10 mg·L-1 TFAE组，20 mg·L-1 TFAE组。取P3代hUCMSCs按5×103/孔接种于96孔板中，每孔200 μL培养基，培养24 h后，更换含不同浓度的TFAE等量培养基。各浓度组均设3个复孔和1个空白孔 (只含药物不含细胞)。分别作用24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37℃孵育2 h后取出，用酶标仪在450 nm波长处测各孔吸光度OD (A) 值，各组吸光度OD=A细胞-A药空白，细胞活性/%=(1-OD实验/OD对照)×100%。
2.3 茜素红染色配制完全成骨诱导液：将hUCMSCs成骨诱导分化培养基试剂盒中的各组分充分混合。实验分4组：空白对照组 (常规培养基)，阳性对照组 (0 mg·L-1 TFAE的成骨诱导培养基)，1 mg·L-1 TFAE组 (1 mg·L-1 TFAE的成骨诱导培养基)，5 mg·L-1 TFAE组 (5 mg·L-1 TFAE的成骨诱导培养基)。取第3代hUCMSCs按2×105个/孔接种于6孔板中，常规培养基培养，待细胞融合达60%~70%，按照分组更换常规培养基或含不同浓度的TFAE成骨诱导培养基，每3天换液一次，诱导14 d后行茜素红染色，培养板拍照及倒置相差显微镜下观察并计算每组10个视野钙结节数量，求平均值。
2.4 AMP法测定ALP活力分组及培养、诱导方法同“2.3”，诱导3、7 d后，按ALP测定试剂盒 (AMP法) 使用说明书步骤操作于405 nm处酶标仪检测各组每分钟吸光度平均变化值A/min，共3 min，根据公式：ALP活力 (U/L)=A/min×F (F=2 713)，计算各组ALP活力。
2.5 RT-PCR检测成骨相关基因表达水平分组及培养、诱导方法同“2.3”，诱导14 d后，按GREENspin组织/细胞快速提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，按HiFiscriptcDNA第一链合成试剂盒说明书将RNA逆转录合成cDNA，按2×Tap Master Mix说明行DNA扩增，PCR扩增反应体系 (共25 μL)：2×Tap Master Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引流1 μL，CDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL，将扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳，SIM凝胶成像系统拍照，条带用Image J软件分析其灰度值。目的基因：Col1a1、OPN、Runx2、Osx，内参：GAPDH。基因引物序列及产物大小见Tab 1。
| Gene | Primer sequence | Product length/bp |
| Col1a1 | forward：5′-CAAAGGCAATGCTCAAACAC-3′ | 777 |
| reverse：5′-GACGCAGGACAGACTAGGAG-3′ | ||
| OPN | forward：5′-ACACATATGATGGCCGAGGTGA-3′ | 116 |
| reverse：5′-GTGTGAGGTGATGTCCTCGTCTGTA-3′ | ||
| ALP | forward：5′-CTCGTTGACACCTGGAAGAGCTTCAAACCG-3′ | 166 |
| reverse：5′-GGTCCGTCACGTTGTTCCTGTTCAGC-3′ | ||
| Osx | forward：5′-GCCAGAAGCTGTGAAACCTC-3′ | 161 |
| reverse：5′-GCTGCAAGCTCTCCATAACC-3′ | ||
| Runx2 | forward：5′-CCACCTCTGACTTCTGCCTC-3′ | 179 |
| reverse：5′-GACTGGCGGGGTGTAAGTAA-3′ | ||
| GAPDH | forward：5′-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′ | 418 |
| reverse：5′-AGGCTGTTGTCATACTTCTCAT-3′ |
分组及培养、诱导方法同“2.3”，诱导14 d后，按总蛋白抽提试剂盒操作说明提取各组细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，每孔蛋白上样量30 μg，进行聚丙烯酰胺 (SDS-PAGE) 凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭，一抗GAPDH (1:4 000)、Col1a1(1:1 000)、OPN (1:1 000) 孵育，1×TBTS洗膜3次，二抗 (1:6 000) 孵育，1×TBTS洗膜3次，暗室中胶片曝光、显影、定影，胶片拍照，条带用Image J软件分析其灰度值。
2.7 统计学分析实验数据以x±s方式表示，用SPSS19.0软件进行数据分析，两组间采用t检验及单因素方差分析。
3 结果 3.1 hUCMSCs形态学观察脐带组织贴壁培养3~5 d后，镜下可见少许细胞爬出 (Fig 1A)，培养10~14 d，组织块周围长满成纤维样细胞 (Fig 1B)，经传代培养后，细胞呈均一的长梭形或纺锤形，排列紧密，呈鱼群样或旋涡状分布 (Fig 1C、D)。
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| Fig 1 Cellular morphology observation (×100) A:Primary hUCMSCs cultured for 5 days; B:Primary hUCMSCs cultured for 12 days; C: hUCMSCs at passage 1 cultured for 2 days; D:hUCMSCs at passage 3 cultured for 3 days |
CCK-8检测结果分析显示：与对照组相比，低浓度TFAE组 (1 mg·L-1 TFAE组、5 mg·L-1 TFAE组) 细胞活性明显增强 (P < 0.05或P < 0.01)，而高浓度TFAE组 (10 mg·L-1 TFAE组、20 mg·L-1 TFAE组) 细胞活性明显减弱 (P < 0.05或P < 0.01)，说明在一定浓度范围内，TFAE促进hUCMSCs增殖，在范围外时则抑制其增殖 (Fig 2)。
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| Fig 2 Effect of TFAE on proliferation in hUCMSCs (x±s, n=4) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
茜素红染色结果及分析显示：诱导14 d后，阳性对照组及不同浓度TFAE组均有钙结节形成，而空白对照组未见钙结节，与阳性对照组，1 mg·L-1 TFAE组及5 mg·L-1 TFAE组颜色加深及钙结节数量明显增多，差异有显著性 (P < 0.01)，说明一定浓度的TFAE能促进hUCMSCs钙结节形成，促进成骨分化 (Fig 3)。
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| Fig 3 Effect of TFAE on calcium nodules formation in hUCMSCs (x±s, n=4) **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs positive control |
AMP法检测ALP结果分析显示：诱导3、7 d后，与空白对照组相比，阳性对照组、1 mg·L-1 TFAE组及5 mg·L-1 TFAE组ALP活力明显增强 (P < 0.05或P < 0.01)，与阳性对照组，1 mg·L-1 TFAE组及5 mg·L-1 TFAE组ALP活力也明显增强，差异显著 (P < 0.05或P < 0.01)，且7 d时各组hUCMSCs的ALP活力均高于3 d时对应各组 (Fig 4)。
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| Fig 4 Effect of TFAE on ALP activity in hUCMSCs (x±s, n=4) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs positive control |
RT-PCR检测结果分析显示：诱导14 d后，与空白对照组相比，阳性对照组、1 mg·L-1 TFAE组及5 mg·L-1 TFAE组成骨相关基因Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表达量明显增加 (P < 0.01)，与阳性对照组，1 mg·L-1 LTFAE组及5 mg·L-1 TFAE组Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表达量也明显增加，差异有显著性 (P < 0.05或P < 0.01)(Fig 5)。
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| Fig 5 Effect of TFAE on expression level of osteogenesis-related gene Col1a1, OPN, Runx2, Osx mRNA in hUCMSCs (x±s, n=4) **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs positive control |
Western blot检测结果分析显示：诱导14 d后，与空白对照组相比，阳性对照组、1 mg·L-1 TFAE组及5 mg·L-1 TFAE组Col1a1、OPN蛋白表达量明显增加 (P < 0.05或P < 0.01)，与阳性对照组，1 mg·L-1 TFAE组及5 mg·L-1 TFAE组Col1a1、OPN蛋白表达量也明显增加，差异有显著性 (P < 0.01)(Fig 6)。
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| Fig 6 Effect of TFAE on expression level of osteogenesis-specific protein Col1a1, OPN in hUCMSCs (x±s, n=4) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs positive control |
hUCMSCs来源于人脐带华通胶组织，是一种多能干细胞，具有强大的增殖及分化潜能，在一定条件下可分化成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肌细胞、内皮细胞、脂肪细胞、肝细胞、胰岛样细胞等[7-11]。骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 是目前组织工程技术中研究较多，应用较广的干细胞。随着hUCMSCs的发现及深入研究，其具有比BMSCs更大的优势，脐带属于医疗废物，因此hUCMSCs来源无创、广泛，易获取，可塑性更强，易培养扩增、免疫原性极低，冻存复苏生物性状不改变，传代培养对细胞增殖及分化能力影响极小，与骨组织工程支架具有良好的相容性，是未来具有广阔应用前景的种子细胞。
黄酮类化合物广泛存在大自然植物体内，具有抗炎、抗氧化、调节免疫、护肝、防治癌症等作用。刺头复叶耳蕨是我国民间传统中药，历史悠久。研究报道刺头复叶耳蕨总黄酮提取物TFAE具有促进肝细胞再生、抗病毒及杀伤癌细胞作用[3-4]。有研究发现多种黄酮类化合物如黄芩苷、淫羊藿有促进细胞增殖及成骨分化作用[12]。本研究发现，低浓度的TFAE (1、5 mg·L-1) 能够促进hUCMSCs增殖，高浓度TFAE抑制其增殖 (10、20 mg·L-1)，说明一定浓度范围TFAE能促进干细胞增殖，因此本实验取1、5 mg·L-1浓度的TFAE研究其在hUCMSCs成骨分化中的作用。
ALP、Runx2、Osx、Col1a1、OPN及钙结节形成是评估成骨分化的重要标志[13]，ALP的表达活性是成骨细胞分化的一个明显的特征，促进磷酸盐形成，在成骨分化早期，ALP表达丰富，在基质沉淀期，钙化的成骨细胞中，ALP表达下降[14]。Runx2是转录因子Runxx家族成员之一，作为一种成骨细胞的特异转录因子，对成骨及骨组织重建起着非常重要的作用，决定着干细胞向成骨细胞分化，调节多种成骨相关基因的表达[15]，有研究报道Runx2基因缺失小鼠，成骨受损，而Runx2过表达导致新骨形成[16-17]。Osx位于Runx2基因下游，也是一种重要的调节成骨细胞分化的转录因子，在成骨分化及骨形成过程中起到非常重要的作用[18-19]。Runx2、Osx是成骨分化早期标志[20]。Col1a1、OPN与成骨分化晚期相关，表达在成熟的成骨细胞中[1]，晚期阶段，成骨细胞最终形成钙结节，而钙结节的形成是MSCs成骨分化的最直接的证据。本研究一系列实验发现，hUCMSCs诱导后，与阳性对照相比，低浓度TFAE组钙结节形成明显增多，ALP活力明显增强，Runx2、Osx、Col1a1、OPNmRNA及Col1a1、OPN蛋白表达上调，成骨分化能力明显增强。
综上所述，低浓度的TFAE具有促进hUCMSCs增殖及成骨分化作用，TFAE中成分较多，具体是什么成分发挥作用及作用机制有待于进一步研究。hUCMSCs也是组织工程领域中理想的种子细胞，应用前景广阔。
( 致谢: 本实验在九江学院基础医学院生化教研室实验室完成，感谢实验室全体成员对本实验的支持与帮助！ )
| [1] | Wu Y, Xia L, Zhou Y, et al. Icariin induces osteogenic differentiation of bone mesenchymal stem cells in a MAPK dependent manner[J]. Cell Prolif, 2015, 48 (3): 375-84. doi:10.1111/cpr.2015.48.issue-3 |
| [2] | Chinese Materia Medica Editorial Board, Chinese Materia Medica, Shanghai Scientific and Technical Press[M]. Shanghai, China, 1st edition, 1999. |
| [3] | Zhou D, Ruan J, Cai Y, et al. Antioxidant and hepatoprotective activity of ethanol extract of Arachniodes exilis (Hance) Ching[J]. J Ethnopharmacol, 2010, 129 (2): 227-32. doi:10.1016/j.jep.2010.03.009 |
| [4] | Li H, Chen J, Xiong C, et al. Apoptosis induction by the total flavonoids from arachniodes exilis in HepG2 cells through reactive oxygen species-mediated mitochondrial dysfunction involving MAPK activation[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2014, 2014: 906-41. |
| [5] | Song L, Zhao J, Zhang X, et al. Icariin induces osteoblast proliferation, differentiation and mineralization through estrogen receptor-mediated ERK and JNK signal activation[J]. Eur J Pharmacol, 2013, 714 (1-3): 15-22. doi:10.1016/j.ejphar.2013.05.039 |
| [6] | 胡文龙, 吴平平, 耿书国, 等. 人脐带间充质干细胞分泌白细胞介素6促进骨肉瘤细胞增殖和迁移[J]. 中国病理生理杂志, 2016, 32 (2): 201-7. Hu W L, Wu P P, Geng S G, et al. hUC-MSCs promote proliferation and migration of osteosarcoma cells by secreting IL-6[J]. Chin J Pathophysiol, 2016, 32 (2): 201-7. |
| [7] | Yoon J H, Roh E Y, Shin S, et al. Introducing pulsed low-intensity ultrasound to culturing human umbilical cordderived mesenchymal stem cells[J]. Biotechnol Lett, 2009, 31 (3): 329-35. doi:10.1007/s10529-008-9872-5 |
| [8] | Jo C H, Kim O S, Park E Y, et al. Fetal mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord sustain primitive characteristics during extensive expansion[J]. Cell Tissue Res, 2008, 334 (3): 423-33. doi:10.1007/s00441-008-0696-3 |
| [9] | Ishige I, Nagamura-Inoue T, Honda M J, et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton′s jelly explants of human umbilical cord[J]. Int J Hematol, 2009, 90 (2): 261-9. doi:10.1007/s12185-009-0377-3 |
| [10] | Campard D, Lysy P A, Najimi M, et al. Native umbilical cord matrix stem cells express hepatic markers and differentiate into hepatocytelike cells[J]. Gastroenterology, 2008, 134 (3): 833-48. doi:10.1053/j.gastro.2007.12.024 |
| [11] | Wu L F, Wang N N, Liu Y S, et al. Differentiation of Wharton′s jelly primitive stromal cells into insulin producing cells in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Tissue Eng Part A, 2009, 15 (10): 2865-73. doi:10.1089/ten.tea.2008.0579 |
| [12] | 李晨睿, 孟志远, 牛银波, 等. 黄芩苷通过Wnt/β-catenin信号通路对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用[J]. 中国药理学通报, 2015, 31 (7): 919-24. Li C R, Meng Z Y, Niu Y B, et al. Baicalin induces osteogenic differentition of rat bone marrow derived mesenchymal stem cells via Wnt/catenin signaling pathway[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31 (7): 919-24. |
| [13] | Nagai H, Kobayashi-Fujioka M, Fujisawa K, et al. Effects of low crystalline carbonate apatite on proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow cells[J]. J Mater Sci Mater Med, 2015, 26 (2): 99. doi:10.1007/s10856-015-5431-5 |
| [14] | Taskiran D, Evren V. Stimulatory effect of 17β-estradiol on osteogenic differentiation potential of rat adipose tissue-derived stem cells[J]. Gen Physiol Biophys, 2011, 30 (2): 167-74. |
| [15] | Chen S, Gluhak-Heinrich J, Wang Y H, et al. Runx2, osx, and dspp in tooth development[J]. J Dent Res, 2009, 88 (10): 904-9. doi:10.1177/0022034509342873 |
| [16] | D′Souza R N, Aberg T, Gaikwad J, et al. Cbfa1 is required for epithelial-mesenchymal interactions regulating tooth development in mice[J]. Development, 1999, 126 (13): 2911-20. |
| [17] | Takahashi T. Overexpression of Runx2 and MKP-1 stimulates transdifferentiation of 3 T3-L1 preadipocytes into bone-forming osteoblasts in vitro[J]. Calcif Tissue Int, 2011, 88 (4): 336-47. doi:10.1007/s00223-011-9461-9 |
| [18] | Wang Y, Zheng Y, Wang Z, et al. 10(-7) m17β-oestradiol enhances odonto/osteogenic potency of human dental pulp stem cells by activation of the NF-κB pathway[J]. Cell Prolif, 2013, 46 (6): 677-84. doi:10.1111/cpr.2013.46.issue-6 |
| [19] | Baek W Y, Lee M A, Jung J W, et al. Positive regulation of adult bone formation by osteoblast-specific transcription factor osterix[J]. J Bone Miner Res, 2009, 24 (6): 1055-65. doi:10.1359/jbmr.081248 |
| [20] | Li Y, Yan M, Wang Z, et al. 17beta-estradiol promotes the odonto/osteogenic differentiation of stem cells from a pical papilla via mitogen-activated protein kinase pathway[J]. Stem Cell Res Ther, 2014, 5 (6): 125. doi:10.1186/scrt515 |