2. 滨州医学院中西医结合学院，山东 烟台 264003
2. College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Binzhou Medical University, Yantai Shandong 264003, China
近年来，急性心肌缺血的发病率不断上升，已经成为影响全球生存率和死亡率的重要原因，临床上挽救急性心肌缺血病人最有效的方法是迅速恢复冠脉血供[1]。然而，心脏在再灌过程中会出现组织、器官功能障碍和结构损伤加重，严重者可转化为不可逆损伤，这种现象称为心肌缺血/再灌注损伤 (myocardial ischemia reperfusion，MIRI)[2]。因此，能否有效防治MIRI是心血管疾病中有待解决的重要问题。
黄酮类化合物是天然强效抗氧化剂，可以减少氧自由基的生成，抑制脂质过氧化、保护生物膜等作用[3]。二氢槲皮素 (dihydroquercetin，DDQ) 是从落叶松根部提取出的一种多酚类黄酮化合物[4]，具有抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、抗病毒[5-7]等多种药理学活性。本研究采用Langendorff离体灌流模型，检测DDQ对离体大鼠MIRI模型的影响，旨在为DDQ的研究和开发以及抗心肌缺血药物的探索提供药理学依据。
1 材料与方法 1.1 动物SPF级SD大鼠40只，♂，体质量 (240±30) g，由新疆医科大学实验动物研究中心提供，实验动物许可证编号: SCXK (新)2011-0003。
1.2 药品与试剂DDQ (纯度为98%，淡黄色粉末，购于上海士锋生物科技有限公司，批号15010710)；水合氯醛 (北京索莱宝科技有限公司，批号811B0215)；K-H液 (NaCl 13.8260 g、KCl 0.7068 g、KH2PO4 0.3210 g、MgCl2 0.2430 g、NaHCO3 4.1836 g、Glucose 4.000 g、CaCl2 0.3300 g, 均为市售国产分析纯试剂)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑 (TTC)(北京索莱宝科技有限公司，批号812F003)；肌酸激酶 (creatine kinase, CK) 试剂盒、乳酸脱氢酶 (lactic dehydrogenase，LDH) 试剂盒、丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 试剂盒、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 试剂盒、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽 (glutathione/oxidized glutathione, GSH/GSSG) 试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。
1.3 方法 1.3.1 实验动物分组及给药健康♂SD大鼠随机分为4组：正常组 (Control)、模型组 (I/R)、DDQ低浓度组 (5 mg·L-1)、DDQ高浓度组 (10 mg·L-1)，每组10只。正常组：全程用K-H液持续全心灌注95 min；模型组：K-H液平衡灌注30 min，停灌20 min后，再灌注45 min；DDQ给药组：K-H液平衡灌注20 min，然后用含有DDQ药液的K-H液灌注10 min，停灌20 min后，K-H液再灌注45 min。用生物多导记录仪实时记录整个缺血/再灌注过程中的血流动力学指标。
1.3.2 Langendorff离体心肌缺血/再灌注模型的建立采用Langendorff造模方法建造大鼠离体心肌缺血/再灌注模型[8]。将大鼠称重后，腹腔注射肝素钠250 U·kg-1抗凝，10%水合氯醛 (0.35 g·kg-1) 进行麻醉。仰卧固定，迅速打开胸腔取出其心脏 (连带较短的主动脉血管)，置于预冷的4 ℃ K-H液中，轻压几下，排出心脏内的余血，迅速将心脏悬挂在Langendorff灌流装置上，使用95% O2和5% CO2混合气体充分饱和的37 ℃恒温K-H缓冲液恒压灌流。
1.4 血流动力学参数的检测剪开离体心脏的左心耳，将自制球囊从左心耳开口处插入左心室，球囊导管连接压力转换器，用4S AD Instruments生物多导记录仪检测各个血流动力学参数:心率 (heart rate，HR)、左室舒张压 (left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室收缩压 (left ventricular systolic pressure，LVSP)、计算左室的发展压 (left ventricular developed pressure，LVDP, LVDP=LVSP-LVEDP)、左室压力最大升高/下降速率 (maximum increase/decrease in the velocity of the left intraventricular pressure，±dp/dtmax)[9]。
1.5 冠脉流出液中CK和LDH含量的测定在停灌前1 min，再灌注后20、45 min时取各组灌流液，冻存于-80 ℃中待测。用生化试剂盒检测各组样本的活性。相关操作严格按照LDH和CK测试盒说明书相关要求进行。
1.6 心肌梗死面积的测定待灌流结束后，取出离体心脏，用PBS冲洗3次，于-80℃极速冷冻10 min后取出，沿着左心室横切面切成2 mm左右的薄片，放置在1% TTC溶液中，37℃恒温避光染色30 min，每5 min翻面一次。染色完成后放入4%的多聚甲醛溶液中固定24 h。心脏缺血区域显灰白色，正常区域显砖红色[10]。采用Image proplus 6.0软件计算心肌梗死面积百分比 (MIS%)=(心肌梗死面积之和/心肌总面积之和)×100%。
1.7 心肌组织中SOD活性，MDA的含量，以及GSH/GSSG的比值的测定心脏样本在冰浴情况下，取左心室约0.3 g，按重量体积比为1 :9的比例加入预冷的生理盐水，在冰浴下进行组织匀浆。组织匀浆液按10 000 r·min-1，4℃条件下离心10 min，取上清液待测。各个指标的测定均严格按生化试剂盒说明书相关要求逐步操作。
1.8 常规组织病理学检测灌流结束后，取各组大鼠心脏。用甲醛固定心脏，然后脱水、包埋、切片、切片厚约5 μm，进行HE染色，用光学显微镜观察心肌病理组织形态学的变化。
1.9 统计学方法实验结果用统计学方法进行分析，以x±s表示，采用SPSS 17.0软件进行数据分析，各组组内比较进行t检验，组间采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 DDQ对大鼠离体心脏血流动力学参数的影响如Tab 1所示，大鼠离体心脏缺血/再灌注之后，与Control比较，模型组中LVDP，±dp/dtmax，HR的结果均明显下降 (P < 0.01)。DDQ预处理组与I/R组进行比较，可明显升高LVDP、±dp/dtmax和HR的数值，并且高剂量DDQ组 (P < 0.01) 的这种保护作用比低剂量DDQ组 (P < 0.05) 更加明显。
| Physical index | Reperfusion/% | |||
| 15 min | 30 min | 45 min | ||
| HR | Control | 91.29±3.75 | 98.59±3.77 | 103.19±5.79 |
| I/R | 61.38±4.88## | 60.02±7.64## | 57.50±6.36## | |
| DDQ/5 mg·L-1 | 74.39±4.75* | 78.86±7.74* | 79.43±6.27 | |
| DDQ/10 mg·L-1 | 95.97±12.25** | 94.60±11.72** | 93.13±9.49** | |
| LVDP | Control | 95.69±7.30 | 94.01±4.80 | 97.58±13.00 |
| I/R | 46.39±6.27## | 47.28±8.43## | 43.33±9.53## | |
| DDQ/5 mg·L-1 | 79.73±4.85 | 75.61±3.16* | 76.44±6.44* | |
| DDQ/10 mg·L-1 | 85.21±7.21** | 82.80±6.06** | 86.24±12.63** | |
| dp/dtmax | Control | 103.04±3.18 | 98.98±0.98 | 95.09±2.32 |
| I/R | 39.95±6.00## | 38.50±6.00## | 41.84±5.95## | |
| DDQ/5 mg·L-1 | 77.56±5.35 | 72.38±5.52* | 74.21±7.42 | |
| DDQ/10 mg·L-1 | 96.49±7.22** | 95.86±6.09** | 92.10±6.40** | |
| dp/dtmin | Control | 90.41±4.47 | 88.33±2.50 | 75.91±2.93 |
| I/R | 45.12±8.39## | 44.26±6.40## | 48.25±3.14## | |
| DDQ/5 mg·L-1 | 71.12±9.12 | 68.45±5.90* | 70.83±7.06* | |
| DDQ/10 mg·L-1 | 82.46±9.10** | 85.12±3.98** | 71.44±8.38** | |
| *P < 0.05，**P < 0.01 vs I/R group; ##P < 0.01 vs control group | ||||
TTC染色结果Fig 1显示，Control梗死区域较少，只有心脏切片边缘存在少许梗死区域。与Control比较，I/R组心肌梗死面积明显增多 (P < 0.01)；与I/R组比较，DDQ预处理均可明显减轻心肌梗死面积 (P < 0.05)，尤其是高剂量DDQ效果最明显，与I/R组之间差异具有显著性 (P < 0.01)。
|
| Fig 1 Effect of DDQ on infarct size ofrats subjected to I/R (x±s, n=10) **P < 0.01 vs I/R group; ##P < 0.01 vs control group |
Tab 2显示，Control中的LDH和CK含量很低，在停灌前10 min、再灌注后20 min、再灌注后40 min各个时间点基本保持不变。与Control相比，I/R组再灌注后LDH和CK含量均明显升高，差异存在显著性 (P < 0.01)。与I/R组相比较，DDQ预处理组在各个时间点的LDH和CK含量都明显降低 (P < 0.05)，DDQ高剂量组变化更加明显 (P < 0.01)。结果显示，DDQ预处理组能够抑制心肌细胞损伤所导致的LDH和CK释放，从而改善心功能。
| LDH and CK Level | 20 min pre ischemia | Reperfusion | ||
| 20 min | 45 min | |||
| LDH/U·L-1 | Control | 19.66±3.92 | 19.37±2.66 | 19.18±3.43 |
| I/R | 20.96±4.08 | 72.28±4.79## | 67.22±8.41## | |
| DDQ/5 mg·L-1 | 21.21±4.95 | 46.13±7.33* | 41.93±4.36* | |
| DDQ/10 mg·L-1 | 20.69±4.29 | 24.54±4.29** | 29.47±3.40** | |
| CK/U·L-1 | Control | 37.78±3.45 | 36.68±8.21 | 36.03±4.58 |
| I/R | 34.64±2.74 | 432.06±19.80## | 211.14±8.32## | |
| DDQ/5 mg·L-1 | 35.06±5.77 | 295.45±13.28* | 227.72±16.05* | |
| DDQ/10 mg·L-1 | 36.21±8.88 | 132.56±2.27** | 85.32±3.14** | |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs I/R group; ##P < 0.01 vs control group | ||||
与Control比较，模型组心肌组织中SOD活力和GSH/GSSG的比值明显降低，MDA含量明显升高，差异有显著性 (P < 0.01)。与I/R比较，DDQ预处理组中受损心肌组织SOD活力升高，MDA含量降低，GSH/GSSG的比值明显升高 (P < 0.01)。表明DDQ预处理组可提高SOD活力，和GSH/GSSG的比值，降低MDA的含量，从而发挥其抗氧化作用。
2.5 心肌组织的病理学改变HE染色的结果如Fig 3所示。光镜下观察各组动物心肌病理显示，Control组 (Fig 3A) 心肌细胞排列整齐、致密，胞质着色均匀，胞核清晰，间质细胞无增生，无明显变性、坏死等改变。I/R组 (Fig 3B) 心肌细胞体积增大呈圆形或类圆形，排列紊乱，着色不匀，部分心肌发生断裂，核裂解消失，心肌细胞明显肿胀。DDQ低剂量组 (Fig 3C) 肌纤维间出现部分充血水肿明显，部分心肌发生断裂，心肌细胞少量肿胀。DDQ高剂量组 (Fig 3D) 心肌损害较I/R组明显减轻，心肌排列较整齐, 着色相对均匀，水肿变性减轻，少量心肌发生断裂，心肌细胞稍肿胀。
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| Fig 2 Effects of DDQ on levels of MDA, SOD and GSH/GSSG in isolated rat hearts subjected to I/R (x±s, n=10) *P < 0.05, **P < 0.01 vs I/R group; ##P < 0.01 vs control group |
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| Fig 3 Myocardium in each group Hematoxylin and eosin (HE) stain (×200).A:Control; B:I/R; C:DDQ/5 mg·L-1; D:DDQ/10 mg·L-1 |
大量研究表明，MIRI的发生可能与氧自由基增多、心肌纤维能量代谢障碍、钙超载、炎症反应、酸中毒等机制有关[11-13]。心肌缺血/再灌注与心功能的变化有着紧密的联系；细胞内漏出的CK和LDH等心肌酶也是反映心肌细胞的损害程度的重要指标。本实验结果表明，I/R诱导心脏出现功能障碍，并导致心肌梗死。然而，DDQ处理组可浓度依赖性的提高大鼠离体心脏中LVDP、±dp/dtmax和HR的指标，减少心肌梗死面积。同时，DDQ预处理组HE染色心肌组织形态学损伤也相对较轻，减少了LDH和CK的漏出量，提示DDQ预处理可以改善血管通透性及微循环，增加心输出量，降低心脏负荷，提高心肌细胞膜的稳定性，从而改善心肌细胞的损害程度。氧自由基在心肌缺血损伤的发生、发展过程中起着重要的作用。心肌缺血/再灌注过程中，心肌组织发生氧化还原反应，产生大量氧自由基[14]。氧自由基可引起心肌组织脂质过氧化反应，产生MDA，导致谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase，GSH-Px) 及超氧化物歧化酶 (SOD) 的活性降低，加重了组织的损伤程度。在本次研究中，我们发现用DDQ预处理后，可提高SOD的活性和GSH/GSSG的比值，降低MDA的含量，并且具有良好的剂量效应关系。充分表明DDQ可通过抑制脂质过氧化反应，清除氧自由基，起到保护心肌的作用。但是DDQ保护心肌缺血/再灌注损伤的具体机制还有待于进一步研究。
综上所述，DDQ预处理可以通过多个方面减轻缺血/再灌注过程中对心肌组织造成的损伤。一方面明显恢复由缺血/再灌注损伤导致的心脏功能抑制，同时减少心肌酶的释放，另一方面也降低了心肌细胞的梗死面积以及心肌组织结构的病变。DDQ的保护作用机制可能与其抗氧自由基损伤有关，本研究为DDQ的临床应用提供研究依据。
( 致谢: 本实验在石河子大学药学院新疆特种植物药资源教育部重点实验室和滨州医学院完成，衷心感谢我的导师郑秋生教授的帮助与支持，感谢实验室同学们的帮助和鼓励! )
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