2. 温州市龙湾区第一人民医院药剂科，浙江 温州 325024
2. Dept of Pharmacy, the First People Hospital of Longwan, Wenzhou Zhejiang 325024, China
抑郁症是由多种原因引起的以心境低落为主要症状的精神疾病。临床主要表现为兴趣减退、情绪低落、思维障碍、睡眠障碍等[1]。目前临床上常用的抗抑郁药物多是基于“单胺神经递质假说”研发，即通过抑制5-HT和去甲肾上腺素转运体功能，以阻断单胺类神经递质在突触间隙的重摄取，增加其在突触间隙的浓度，从而改善抑郁症状。然而这些药物存在效率低，治疗效果缓慢，停药易复发等不足。因此，寻找有效的防治抑郁症的新型抗抑郁药物是当前的研究热点。神经炎症是抑郁症至关重要的病理学基础，多种经典的抗抑郁治疗均能改善神经炎症而发挥抗抑郁作用。研究发现抑郁症病人脑脊液中炎症因子水平升高[2]。此外，动物实验研究表明，给予IL-6、IL-1β、TNF-α或者脂多糖 (LPS) 能诱导动物抑郁样行为[3]。他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA) 还原酶抑制剂，能减少细胞内胆固醇合成，降低血清胆固醇水平。此外，他汀类药物对免疫炎症和氧化应激均有不同程度的预防和治疗作用[4]。近年来[5-6]，有研究表明辛伐他汀可通过增加脑内神经营养因子表达，抑制细胞凋亡和神经炎症水平，在中枢神经系统发挥神经保护作用。本文旨在观察辛伐他汀对LPS诱导的小鼠抑郁行为和神经炎症的影响，为进一步解释抑郁症的病理生理机制、发掘更有效的抗抑郁药物奠定基础。
1 材料 1.1 实验动物ICR小鼠，♂，清洁级，体质量 (24±2) g，共40只，由温州医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK (浙)2010-0044。小鼠自由摄食摄水，饲养温度为 (22±2)℃，湿度55%±5%，8 :00~20 :00照明环境。
1.2 试剂与仪器辛伐他汀 (Simvastatin，Sim，购于杭州默沙东有限公司)；脂多糖 (LPS，购于Sigma Aldrich公司；NF-κB p65抗体 (购于Cell Signaling Technology公司)；IL-1β抗体 (购于Santa Cruz Biotechnology公司)；TNF-α抗体 (购于Santa Cruz Biotechnology公司)；组蛋白3抗体 (Histone 3，购于Bioward Technology公司)；抗兔二抗 (购于Bioward Technology公司)；其他试剂为分析纯。
酶标仪 (Thermo scientific)；紫外-可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司)；台式高速冷冻离心机 (TGL-16型，湖南湘仪实验室开发有限公司)；Sartorius分析天平 (TP-114型，北京塞多利斯天平有限公司)；凝胶成像系统 (Tanon-4200，上海天能科技有限公司)。
2 方法 2.1 动物分组和给药将小鼠适应性饲养3 d，按体质量随机挑选10只为正常对照组，10只为LPS组，10只为LPS+Sim 10 mg·kg-1组，10只为LPS+Sim 20 mg·kg-1组。辛伐他汀溶于0.5% CMC-Na中。连续灌胃给予小鼠辛伐他汀1周，期间给予正常对照组和LPS组小鼠等剂量0.5% CMC-Na。在最后一次给药结束24 h后，除正常对照组外，其余30只小鼠单次腹腔注射LPS 0.5mg·kg-1，正常对照小鼠单次腹腔注射等剂量生理盐水。
2.2 行为学测试在注射LPS 24 h后，对各组小鼠进行行为学测试。
2.2.1 旷场实验 (open field test，OFT)测试箱为50cm×50cm×40cm的塑料箱，底部黑色，四壁为白色。设定ANY-MAZE采集软件的实验参数。采集时间为5 min。采集指标选择穿越格子的总次数以及移动总距离。实验开始时将每只小鼠面朝箱壁放入测试箱内任一角落，记录随后5 min内小鼠的自发活动。每次测试结束后清除小鼠排泄物，使用70%的酒精擦拭箱底及四壁，待酒精挥干后进行下一只鼠测试。
2.2.2 强迫游泳实验实验测试器为直径12cm，高33cm的圆柱形有机玻璃圆筒。往圆筒内倒入一定量的温水，使水深达到20cm，测试水温为 (25±2)℃。测试时，将小鼠放入有机玻璃圆筒内，使用ANY-MAZE视频采集系统软件采集6 min内小鼠的不动时间，记录后4 min内小鼠的不动时间。每只小鼠结束实验后，放在暖风机旁烘干，并更换圆筒内的水。
2.2.3 糖水偏好度测试将小鼠单笼饲养，提前20 h禁食禁水。分别称量饮用水及蔗糖水的重量。禁食禁水结束后，将两瓶饮用液体同时插入鼠笼上，使小鼠可饮用两瓶液体，这一过程维持1h。1 h结束后分别称量两瓶液体的重量。计算差值得出小鼠的饮用水的重量、饮用蔗糖水的重量及糖水偏好度 (饮用的蔗糖水量/饮用的总液体量)。
2.3 Western blot检测前额叶皮层NF-κB p65、IL-1β、TNF-α表达水平总蛋白提取：处死动物、取脑，分离脑前额叶皮质，称重。按质量 (g):体积 (mL) 为1 :9的比例加入RIPA缓冲液 (单去污裂解液：PMSF=1 :9)，制备组织匀浆，低温离心 (4 ℃，12 000×g，5 min)，收集蛋白样液，并运用BCA法测定蛋白浓度。核蛋白提取：将前额叶皮质用低渗裂解液进行匀浆裂解 (1 mL低渗裂解液中含有5 μL磷酸酶抑制剂、10 μL PMSF和1 μL DL-二硫苏糖醇)，3 000×g离心5 min。沉淀再用低渗裂解液进行溶解，5 000×g离心5 min获得沉降物溶于200 μL裂解液，低温处置20 min后，4 ℃ 15 000×g离心10 min吸取上清蛋白样液，行BCA法定量。配制上样液 (1 μL溶液含4 μg蛋白)，100 ℃加热10 min变性后，-80 ℃保存备用。制备分离的电泳凝胶，每孔分别加入10 μL的蛋白样液；按电压强度为80 V进行浓缩，120 V进行分离。将所需的目的蛋白转移到PVDF膜上，并用脱脂奶粉 (TBST溶解) 封闭膜上未吸附蛋白区来减少非特异性结合的影响；而后用脱脂奶粉稀释的抗体孵育，即用NF-κB p65抗体 (1 :1 000稀释)、IL-1β抗体 (1 :200稀释)、TNF-α抗体 (1 :200稀释)、β-actin抗体 (1 :5 000稀释)、组蛋白H3抗体 (1 :500稀释)4 ℃孵育过夜，然后用TBST洗净，PDVF膜用抗兔二抗 (1 :5 000稀释)，室温下孵育2 h后洗净，Tanon-4200凝胶成像系统显色成像。以β-actin或组蛋白H3作为内参照，采用Gel-Pro Analyzer 4软件进行分析处理，以每个条带的积分吸光度值 (integrated absorbance，IA) 与其相对应的β-actin或组蛋白H3的比值表示蛋白的表达水平。
2.4 统计学分析所有数据均用x±s表示。采用SPSS 11.6软件进行分析。数据采用单因素方差分析 (one-way ANOVA)，Post hoc test采用Dunnett't-test进行统计分析。
3 结果 3.1 辛伐他汀抑制LPS诱导的小鼠抑郁样行为强迫游泳实验 (FST) 和悬尾试验 (TST) 结果显示，与正常对照组相比，LPS模型组小鼠不动时间明显延长 (P < 0.05)，表明LPS诱导了小鼠抑郁样行为。提前连续灌胃给予小鼠辛伐他汀 (10或20 mg·kg-1)1周能明显预防LPS诱导的小鼠不动时间的延长 (P < 0.05)，表明辛伐他汀能够预防LPS诱导的行为绝望 (Fig 1A, B)。此外，我们对各组小鼠进行了旷场实验 (OFT)。实验结果显示，各组小鼠的穿格次数和行径总距离差异无显著性 (P>0.05)，说明LPS和辛伐他汀没有影响小鼠的自发活动 (Fig 1C)。此外，我们采用糖水偏好度 (SPF) 评价小鼠抑郁表型的一个重要指标--快感缺乏。实验结果显示，LPS明显降低小鼠糖水偏好度 (P < 0.05)，而提前连续灌胃给予辛伐他汀1周能明显预防LPS诱导的小鼠糖水偏好度降低 (P < 0.05)，表明辛伐他汀能够预防LPS诱导的快感缺乏 (Fig 1D)。
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| Fig 1 Simvastatin prevents LPS-induced depressive behaviors (x±s, n=10) Male mice were administered with simvastatin (10 or 20 mg·kg-1) for consecutively 7 days. Then mice were injected with LPS (0.5 mg·kg-1). 24 h later, mice were exposed to behavior tests. Shown are the immobility time in the FST (A) and TST (B), total distance and line crossings in the OFT (C) and preference of surcose in the SPF (D). *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 vs LPS model group. |
我们采用Western blot检测了前额叶皮层 (prefrontal cortex, PFC) 内NF-κB p65的表达。实验结果显示，LPS明显增加PFC内NF-κB p65水平 (P < 0.05)，而辛伐他汀能够预防LPS诱导的NF-κB p65表达增加 (P < 0.05)(Fig 2A)。此外，我们采用Western blot检测了辛伐他汀对LPS诱导的抑郁小鼠PFC内炎症因子水平的影响。实验结果显示，LPS能明显增加PFC内IL-1β、TNF-α水平 (P < 0.05)。提前连续给予辛伐他汀 (10或20 mg·kg-1)1周能明显预防PFC内IL-1β、TNF-α水平增加 (P < 0.05)(Fig 2B, C)。因此，辛伐他汀可能通过调控NF-κB信号通路进而降低脑内炎症因子水平而发挥抗神经炎症作用。
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| Fig 2 Simvastatin inhibits LPS-induced LPS-activated NF-κB pathway and increment of pro-inflammatory cytokines Nuclear extracts were prepared from prefrontal cortex and nuclear NF-κB p65, IL-1β, TNF-α and histone H3/β-actin as loading control were examined by Western blot by respective antibodies, and quantification of NF-κB p65, IL-1β and TNF-α were presented as the ratio (in percentage) of control group. Data shown are expressed as x±s (n=4). *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs LPS model group. |
越来越多的研究表明，神经炎症是抑郁症重要的病理学基础，抑郁症病人常伴有脑内炎症因子水平增加，而给予抗抑郁治疗后，脑内炎症因子水平下降[7-8]。本研究采用单次腹腔注射LPS (0.5 mg·kg-1) 诱导抑郁小鼠模型，观察连续灌胃给予辛伐他汀1周对小鼠抑郁表型以及脑内炎症因子表达的影响。研究结果显示，辛伐他汀能够抑制LPS诱导的小鼠抑郁样行为，产生抗抑郁作用。此外，辛伐他汀能够抑制NF-κB信号通路进而降低脑内炎症因子水平。
大量的研究表明LPS能够诱导啮齿类动物抑郁表型，且单次注射LPS常被用来诱导炎症相关的小鼠抑郁症状[9]。LPS诱导的病理行为包括摄食减少、睡眠障碍、对疼痛的敏感性增加，快感缺乏[10]。
这些症状与临床上抑郁症患者的表现相似。诸多的文献报道，单次腹腔注射LPS 0.5 mg·kg-1可在24 h后能够明显诱导小鼠出现抑郁表型[7, 11]。本研究中，我们采用单次腹腔注射LPS 0.5 mg·kg-1，结果显示LPS能明显诱导小鼠在TST和FST中不动时间的增加，降低糖水偏好度，表现出抑郁样行为。
辛伐他汀是脂溶性他汀类药物，可透过血脑屏障，在临床上被广泛用于降低血浆胆固醇水平。有研究表明，辛伐他汀具有良好的神经保护作用，能够明显改善脑出血、脊柱损伤、颅脑损伤的预后和神经功能[5-6]。此外，有临床研究表明，辛伐他汀能够降低患抑郁症和焦虑症的风险。然而，关于辛伐他汀对抑郁症的影响和机制还未被完全阐明。我们的实验结果表明，辛伐他汀能够明显改善LPS诱导的小鼠抑郁样行为，降低小鼠的行为绝望，增加小鼠的糖水偏好。此外，神经炎症被认为是抑郁症的重要病理原因之一，许多临床前和临床研究表明，抗抑郁药物能够明显改善抑郁症患者神经炎症水平[7-8]。因此，辛伐他汀的抗炎特性可能是其发挥抗抑郁作用的重要原因。我们的研究结果证明辛伐他汀能够明显降低前额叶皮层IL-1β、TNF-α蛋白水平。
NF-κB蛋白家族 (RelA/p65、RelB、c-Rel、p50、p52) 在中枢神经系统中分布广泛，其在多种神经炎症相关疾病中表达增加[12-13]。NF-κB作为早期转录因子，参与炎症反应各个阶段诸多炎症因子的生成，包括IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6、iNOS、趋化分子、粘附分子等。NF-κB激活后，脑内一系列炎症因子表达增加。而这些炎症因子表达增加造成神经细胞损伤，促进神经细胞死亡。有研究报道辛伐他汀能够抑制NF-κB信号通路[7, 14]，我们的研究表明LPS可激活前额叶皮层NF-κB，增加NF-κB表达，进而上调IL-1β、TNF-α等炎症因子水平。有趣的是，辛伐他汀能够抑制NF-κB信号通路，减少前额叶皮层IL-1β、TNF-α水平。
综上所述，辛伐他汀可能通过调节NF-κB信号通路进而减少脑内IL-1β、TNF-α等炎症因子水平，发挥抗抑郁作用。有望被二次开发为防治炎症相关抑郁症的药物，进而为多环节治疗抑郁症提供新思路。
( 致谢: 本研究在温州医科大学附属第一医院中心实验室完成。感谢徐慧、王晨之、许巧巧、戴歌心对实验操作的帮助，感谢徐慧、余旭奔、胡卢丰对文章写作的指导。 )
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