2. 上海中医药大学 科技实验中心，上海 201203;
3. 上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心，上海 201203
2. Experiment Center for Science and Technology, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China;
3. Murad Research Institute for Modernized Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
由于生活节奏加快和工作压力增大，抑郁发病率正在逐年增多，严重威胁人类身心健康。世界卫生组织预期到2020年抑郁症可能成为仅次于冠心病的第二大疾病[1]。在中国，抑郁症是14~35岁人群非正常死亡的首要原因[2]。抑郁症属于情感性精神障碍，以持久的情感低落为主要症状，并伴随思维过程和思维内容障碍及意志活动减弱的综合症状，涉及多机制的复杂病。中药复方藜欢解郁在长期临床应用中表现出良好的抗抑郁作用, 且最新开发的藜欢解郁胶囊在大鼠抑郁模型中具有明确的抗抑郁作用[3]。蒺藜是藜欢解郁胶囊 (蒺藜、合欢花、甘草、石菖蒲) 重要组成药物之一，而蒺藜皂苷Gross saponins of Tribulus terrestris (GSTT) 是蒺藜主要药效成份，研究发现刺蒺藜苷具有促进海马神经元发生作用，本实验拟通过研究蒺藜皂苷在慢性不可预见性刺激诱导抑郁大鼠中的作用，并探讨其可能的作用机制，为临床治疗抑郁症提供指导。
1 材料与方法 1.1 实验动物Wistar大鼠，180~220 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司, 在上海中医药大学动物实验中心饲养 (25±1)℃, 40%~60%相对湿度, 昼夜各12 h SPF级房间自由饲养，合格证号：上海斯莱克 (沪)2012-0002。
1.2 药品与试剂蒺藜皂苷，生产厂家：陕西永源生物科技有限公司，批号：YYS-006。盐酸氟西汀 (百忧解)，生产厂家：苏州礼来，批号：2061。乙醇 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号20111228)；甲醇 (国药集团化学试剂有限公司，批号T20111214)；磷酸化蛋白酶抑制剂 (谷歌生物，批号G2007)；BCA蛋白定量检测试剂盒 (Bio-rad，批号500-0002)；SDS (美国Amresco公司，批号0227)；过硫酸铵AP (Amresco，批号A0486)；四甲基乙二胺TEMED (Sigma公司，批号T8133)；硝酸纤维素膜 (上海依科赛生物制品有限公司，批号CS011-0001)；ECL化学发光显色剂 (上海优宁维生物科技有限公司，批号WBKLS0500)；NFKB (Santa Cruz，批号sc-372)；IDO (Santa Cruz，批号SC-25809)；β-actin (Santa Cruz，批号SC-1616R)；丙烯酰胺Acr (Amresco，批号0341)；甘氨酸 (Amresco，批号0167)；TRIS (Sigma，批号93349)；beta-巯基乙醇 (Sigma，批号BY-12286)；二抗 (山羊抗兔lgG)(上海碧云天生物技术研究所，批号A0208)；RIPA裂解液 (上海碧云天生物技术研究所，批号P0013B)。
1.3 主要仪器设备液相质朴联用仪 (安捷伦，型号DEBAF01206)；C18色谱柱 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm) 来源Waters；开放旷场及强迫游泳测试仪器购自上海玉研；电子天平 (JA1003型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；台式离心机 (KA-1000型，上海安亭科学仪器厂制造)
1.4 动物分组及造模Wistar大鼠 (SPF级)48只 (180 g~200 g)，适应性饲养1周，随机分为6组，每组8只。即空白组 (生理盐水，1 mL/100 g)，模型组 (生理盐水，1 mL/100 g), 阳性药百忧解组 (盐酸氟西汀组1 mg·kg-1), 蒺藜皂苷低剂量组 (31.25 mg·kg-1), 蒺藜皂苷中剂量组 (62.5 mg·kg-1), 蒺藜皂苷高剂量组 (125 mg·kg-1)。大鼠采取单笼饲养且以慢性轻度不可预见性应激 (UCMS) 为造模方法，使大鼠在21 d内接受各种不同的不可预知的应激刺激，8种应激因子按随机分布表随机安排到21 d中，平均每种刺激各2次：①昼夜颠倒 (24 h)；②禁食禁水 (24 h)；③潮湿垫料 (将200 mL水加入有锯木屑的笼底，24 h)；④鼠笼倾斜，摇晃 (速率1次/s，15 min)；⑤ 40 ℃高温环境 (5 min)；⑥夹尾 (1 min)；⑦ 4 ℃冰水游泳 (5 min)；⑧陌生异常物品 (如塑料杯、木勺等)。除空白组外，其余大鼠按程序给予相应刺激。连续相同时间灌胃21 d，药物用生理盐水溶解，阳性药组和蒺藜皂苷组按照1 mL/100 g体积灌胃，空白组和模型组给予等体积生理盐水。
2 指标检测 2.1 旷场实验[4]d 21，灌胃1 h后，取旷场反应箱，每次放入1只大鼠在敞箱正中格中，然后进行观察。记录其5 min内由底面中心开始走动的穿越格数，计算总路程和站立次数。
2.2 悬尾实验d 21，灌胃1 h后，用胶带黏住老鼠尾端2 cm处，悬挂距地高50 cm的架子上，老鼠处于倒挂状态。摄像6 min，观察后4 min大鼠不动时间。不动时间以老鼠静止垂直倒悬为准。
2.3 血清神经递质检测大鼠麻醉用未抗凝的离心管取血，13 000 r·min-1，15 min，4 ℃离心取上清200 μL，加入10 μL内标 (3, 4-二羟基苄胺，10 mg·L-1，甲醇溶)，再加入700 μL的0.1%甲酸-甲醇，涡旋1 min，13 200 r·min-1，4℃离心15 min，取上清，氮气吹干后，加入100 μL初始流动相 (0.1%甲酸-水:乙腈=98 :2) 复溶，涡旋1 min，再13 200 r·min-1，4℃离心15 min，小心吸取上清90 μL至装有内衬管的进样小瓶中，10 μL进样。
2.4 实时定量PCR分析大鼠麻醉后取出大脑，分离出海马组织于1.5 mL灭菌离心管中，加入1 mL TRIzol匀浆后，按照试剂说明提取总RNA。用DNaseI出路去除DNA后，用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas) 逆转录为cDNA，使用Taqman SYBR kit (Life Technologies) 试剂盒操作方法进行实时定量PCR。
2.5 蛋白质免疫印迹分析大鼠麻醉后取出大脑，分离出海马组织剪碎于1.5 mL灭菌离心管中加入300 μL RIPA试剂冰上超粉碎放30 min, 取出以12 000 r·min-1，15 min，4℃离心，取上清于新离心管中。测定蛋白浓度并定量，以10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜，以含5%脱脂牛奶的TBST稀释封闭1 h，一抗 (1 :1 000)，β-actin (1 :5 000)4℃封闭摇床过夜。用TBST室温洗3次，5 min/次。二抗用含0.5%脱脂牛奶TBST溶液室温封闭1 h，取出条带TBST洗3洗，5 min/次。ECL试剂显色，图片经AlphaEase FC分析软件扫描灰度值。
2.6 LC-MS/MS色谱条件参考本实验室已发表文献[5]。既：以甲酸-水 (1 :1 000，A相)，乙腈 (B相) 为流动相进行梯度洗脱，0~4 min，0.02 B；6 min，0.8 B；8~10 min，0.9 B；流速为0.1 mL·min-1。
2.7 统计学分析应用GraphPad Prism 5统计学软件分析进行单因素方法分析。数据结果以x±s表示。
3 结果 3.1 蒺藜皂苷对大鼠开放旷场运动距离的影响模型组和空白组相比，有明显差异。说明抑郁模型成功。和模型组相比较，蒺藜皂苷低、高剂量组有明显差异，中剂量能减少开放旷场运动距离。说明蒺藜皂苷能减少开放旷场大鼠运动距离具有抗抑郁作用。和模型组比，百忧解组有明显差异，说明百忧解有抗抑郁作用，见Tab 1。
| Group | Dose/mg·kg-1 | Total distance/cm |
| Sham | / | 1145.85±392.46 |
| Model | / | 1672.41±418.23# |
| Fluoxetine | 1 | 1213.55±534.93* |
| GSTT | 31.25 | 981.51±543.53* |
| 62.5 | 1179.23±561.13 | |
| 125 | 1143.11±552.91* | |
| #P < 0.05 vs sham；*P < 0.05 vs model | ||
和空白组比较，模型组大鼠开旷站立次数明显增加有统计差异，说明模型构建成功。和模型组比较，蒺藜皂苷低、中、高剂量组大鼠站立次数减少有明显差异，说明蒺藜皂苷有抗抑郁模型大鼠作用。和模型组比较，百忧解组大鼠站立次数明显减少，说明百忧解具抗抑郁作用。见Tab 2。
| Group | Dose/mg·kg-1 | Number of standing |
| Sham | / | 9.67±5.52 |
| Model | / | 17.67±7.84# |
| Fluoxetine | 1 | 7.11±4.57* |
| GSTT | 31.25 | 6.00±4.04* |
| 62.5 | 7.33±4.50* | |
| 125 | 5.33±3.33* | |
| #P < 0.05 vs sham；*P < 0.05 vs model | ||
和空白组比较，模型组大鼠悬尾不动时间明显增加有明显差异，说明造模成功。和模型组相比，蒺藜皂苷低剂量组降低大鼠悬尾不动时间，蒺藜中、高剂量组能明显降低大鼠悬尾不动时间，说明蒺藜皂苷具有对抗抑郁作用。和模型组比，百忧解组，能明显降低大鼠悬尾不动时间，说明百忧解具有对抗抑郁作用。见Tab 3。
| Group | Dose/mg·kg-1 | Tail suspension test/s |
| Sham | / | 93.69±46.22 |
| Model | / | 152.56±37.55# |
| Fluoxetine | 1 | 87.44±44.55* |
| GSTT | 31.25 | 109.75±60.91 |
| 62.5 | 103.50±41.52* | |
| 125 | 67.60±47.44* | |
| #P < 0.05 vs sham；*P < 0.05 vs model | ||
如Fig 1A，和空白组比较，模型组5-HT明显减少，蒺藜皂苷低剂量组和百忧解能明显升高血液5-HT含量，蒺藜中、高剂量组能明显升高血液5-HT水平。如Fig 1B，和模型组比，蒺藜皂苷高剂量组GABA明显提高。如Fig 1C，和模型组比较，蒺藜皂苷高剂量给药组Glu含量差异有统计学意义。Fig 1D，NE水平没有明显变化。
|
| Fig 1 Effect of GSTT on neurotransmitters in blood of rats (x±s, n=8) *P < 0.05 vs model |
和空白组比较，模型组大鼠海马中IDO、IL-1β均上调, IL-10没有明显变化。和模型组比较给药组IDO、IL-1β均下调，其中蒺藜低中高剂量组对IDO基因明显下调。百忧解、蒺藜皂苷中、高剂量组IL-1β明显下调，蒺藜皂苷高剂量组能明显上调抗炎因子IL-10。见Tab 4。
| Group | Dose/mg·kg-1 | IDO | IL-10 | IL-1β |
| Sham | / | 1.23±0.25 | 1.05±0.13 | 0.94±0.25 |
| Model | / | 1.60±0.29 | 1.50±0.41 | 1.21±0.25 |
| Fluoxetine | 1 | 1.36±0.29 | 1.54±0.64 | 0.65±0.25* |
| GSTT | 31.25 | 0.99±0.27* | 1.63±0.54 | 0.74±0.31 |
| 62.5 | 0.82±0.14* | 1.64±0.30 | 0.76±0.26* | |
| 125 | 0.82±0.11* | 2.37±0.82# | 0.74±0.27* | |
| #P < 0.05 vs sham；*P < 0.05 vs model | ||||
和空白组相比，模型组IDO、NF-κB蛋白表达量明显增加。和模型组比较，百忧解、蒺藜皂苷低中、高剂量组IDO、NF-κB蛋白表达量明显降低。见Fig 2。
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| Fig 2 Effect of GSTT on IDO proteinexpression in hippocampus of rats (x±s, n=3) #P < 0.05 vs sham; *P < 0.05 vs model |
抑郁症是一种情感性精神障碍，并伴随情绪低迷、意志活动减弱，对外界刺激敏感度降低。身体特征的改变是生理和心理的综合作用的外在体现，包括行为和体重上的改变。开放矿场和悬尾实验是经典的筛选抗抑郁药物的方法，通过记录矿场运动距离和悬尾不动时间，评价动物的抑郁症状[6]。蒺藜皂苷低、高剂量对抑郁大鼠矿场实验总路程和站立次数都有明显减少作用，蒺藜皂苷中剂量对于抑郁大鼠悬尾不动时间都明显减少而高剂量有明显减少效果。提示蒺藜皂苷对抑郁大鼠有改善作用，表现出抗抑郁作用。
研究发现，在慢性轻度不可预见性刺激抑郁模型动物海马和血液中单胺类神经递质5-羟色胺 (5-HT)、甲肾上腺素 (NE) 和多巴胺 (DA) 会减少[7]。5-HT作为中枢神经系统重要的神经递质参与情绪的调节，5-HT水平低的人群易发抑郁。实验结果表明蒺藜皂苷低剂量能明显提高血液中5-HT水平，且蒺藜皂苷中、高剂量能够明显增加血液中5-HT水平。GABA作为脑内抑制性神经递质，与情感和行为密切相关，GABA水平降低病人肥胖、脾气暴躁和强迫症概率高于正常人群[8]。实验结果发现蒺藜高剂量能提高抑郁大鼠血液GABA水平，提示蒺藜皂苷抗抑郁作用可能与提高血液中单胺类神经递质5-HT和GABA含量有关。
细胞因子在与抑郁症密切相关的脑区如海马、杏仁核、前脑皮质的5-HT转化中起到重要作用，这其中一种色氨酸前体 (precursor tryptophan, TRP) 代谢酶——吲哚胺2，3-双加氧酶 (IDO) 在其中发挥了重要作用。慢性轻度不可预见性刺激条件下大鼠皮层和海马中TNF-α和IDO蛋白表达明显升高[9]。IDO能被被炎性细胞因子激活，激活状态的IDO能够影响5-HT的生成和代谢。当IDO被炎性细胞因子如IL-1β、TNF-α过度激活后，将分解大量5-羟色胺的前体色氨酸，导致代谢为变为犬尿氨酸 (kynurenine, KYN)，以至5-HT生成的上游原料不足，5-HT生成降低[10]。同时使色氨酸-犬尿氨酸代谢通路的下游产物犬尿喹啉酸 (kynurenic acid, KYNA)，喹啉酸 (quinolinic acid, QUIN) 生成积聚增多，这些产物都是在多种神经退化条件下的神经毒性物质，其中3OH-KYN可能导致氧自由基过量产生和单胺氧化酶活性增加，导致5-HT的快速消耗，进一步加剧了突触前可利用5-HT的降低而导致抑郁症[11]。同时研究也发现大鼠慢性长期处于孤立状态诱导焦虑和抑郁发生同时Nrf2-Keap1-ARE信号通路被激活，海马中Nrf2减少而Keap1和NF-κB增加[12]。实验结果表明，和空白组比较，模型组海马IDO和IL-1β基因表达上调，IDO蛋白明显增加。和模型组比较，蒺藜皂苷中、高剂量组海马IDO基因和蛋白都明显减少。蒺藜皂苷低、高剂量组炎性细胞因子IL-1β基因表达明显上调，蒺藜皂苷高剂量组抗炎因子IL-10基因明显提高。提示蒺藜皂苷具有抗抑郁作用，其可能的机制是通过增加血液中单胺类神经递质5-HT和GABA含量，抑制海马中色氨酸前体酶-吲哚胺2，3-双加氧酶 (IDO) 基因和蛋白表达，减少5-HT前体物质消耗，以及下调海马中炎性细胞因子IL-1β基因和上调抗炎因子IL-10基因等多种途径发挥抗抑郁作用。
( 致谢: 本实验在上海中医药大学中药产学研实验室由本人主要参与完成，在俞仲毅老师、梅泰中老师和胡凯莉老师的帮助指导下进行。感谢我的导师刘梅老师在学术文章撰写多方面的指导。 )
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