2. 中南大学湘雅医学院分子生物学研究中心，湖南 长沙 410078
2. Molecular Biology Research Center, Xiangya Medical College, Central South University, Changsha 410078, China
乳腺癌目前已成为威胁妇女生命和健康的头号杀手，倍受世界各国瞩目[1-3]。顺铂 (DDP) 为广谱抗癌药物，具有细胞毒作用，其主要靶点为DNA，与DNA结合可诱导DNA严重损伤，从而导致细胞凋亡。DNA双键断裂 (DSBs) 是最严重的DNA损伤之一，γ-H2AX焦点数和DSBs有1 :1的关系, γ-H2AX目前已逐渐成为衡量DNA损伤程度的金标准之一[4]。共济失调-毛细血管扩张突变基因 (ATM) 主要介导DSBs诱导的H2AX的磷酸化，并且还能诱导诸多DNA损伤信号通路中的关键应激蛋白，其具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性, 可以作用于下游靶蛋白相应丝氨酸 (Ser) 或苏氨酸 (Thr) 位点, 在DNA损伤识别和修复中处于最关键的位置[5]。Cleaved caspase-3与化疗药物作用引起细胞凋亡密切相关，cleaved caspase-3在胞质中是以无活性的酶原形式存在, 然而，当许多细胞外凋亡信号使之激活为有活性的cleaved caspase-3时, 引起细胞内关键蛋白酶的失活, 导致细胞凋亡[6]。研究表明，钙蛋白酶calpain与肿瘤细胞的凋亡关系十分密切[7]。本研究旨在分析DDP处理乳腺癌MCF-7细胞后发生DNA损伤时所引起的相关蛋白表达的变化情况，运用MTT法、Hoechst 33258荧光染色及Western blot检测DDP处理MCF-7细胞后对细胞凋亡、细胞形态学及凋亡相关蛋白表达的影响, 为顺铂作用乳腺癌MCF-7细胞的DNA损伤反应的研究提供相关的实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞培养人乳腺癌细胞株MCF-7细胞，来源于1位69岁高加索妇女乳腺癌 (腺癌) 患者胸膜渗出液中的癌细胞，该细胞株由中南大学分子生物学研究中心提供。培养体系为含10%小牛血清的DMEM培养基，在37℃、5% CO2孵箱中培养。
1.1.2 试剂DMEM干粉和小牛血清购于美国Gibco公司；二甲基亚砜 (DMSO) 购自Sigma；PVDF膜购于罗氏；30% Acr-Bis、1 mol·L-1 Tris-HCl pH 8.8、1 mol·L-1 Tris-HCl pH 6.8购自碧云天；预染蛋白Marker购自碧云天；100 bp ladder DNA Marker购自Fermentas。
1.1.3 抗体ATM鼠抗人单抗购于Abcam公司；γ-H2AX (Ser139) 兔抗人单抗购于Bioworld公司；cleaved caspase-3(Asp 175) 鼠抗人单抗购于Cell Signaling Technology公司；calpain兔抗人单抗、DAB显色剂均购自北京中杉生物技术有限公司；二抗羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均购自碧云天生物有限公司。
1.2 MTT测定DDP作用于MCF-7细胞的的IC50值将对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔培养板中, 每孔加入200 μL，按不同浓度的DDP进行处理 (0、2、4、6、8、10 mg·L-1)，每孔加入100 μL无血清的DMEM和20 μL浓度为5 g·L-1的MTT试剂，37℃继续培养4 h，每孔加入150 μL DMSO，采用490 nm和630 nm波长在酶标仪上检测各孔吸光度, 记录结果。用各组不同浓度的细胞抑制率及浓度制作标准曲线, 计算IC50值。细胞抑制率/%=(1-实验组的平均OD值/对照组的平均OD值)×100%。
1.3 Hoechst 33258荧光染色观察MCF-7细胞凋亡将对数生长期MCF-7细胞分别接种于混有不同培养液的培养皿中，分别为空白对照组 (0 mg·L-1的DDP)、含5%胎牛血清的DMEM、含10%胎牛血清的DMEM、顺铂组 (7.57 mg·L-1 DDP的培养基2 mL)，接种96孔培养板，每孔600 μL (1.0 ×105细胞/孔)，48 h后，PBS洗涤细胞，加0.5 mL 10 mg·L-1 Hoechst 33258荧光染色，37℃孵育8 min，PBS洗涤3次，每次5 min, 荧光显微镜下观察细胞形态，重复3次。
1.4 Western blot把待处理的MCF-7细胞分为实验组和对照组，实验组即DDP组 (2、4、6、8、10 mg·L-1)，对照组即空白对照 (DDP为0 mg·L-1)。Western blot具体步骤如下:取等质量的各组蛋白质与5×SDS混匀，热变性5 min后点样；用Bio-Rad电泳仪在60 V和浓缩胶中电泳1 h，之后在100 V和分离胶中电泳2~4 h (ATM蛋白分子质量为350 ku，SDS-PAGE凝胶电泳采用7.5%的分离胶，同样的电压下电泳6 h); Bio-Rad湿转膜仪在80 V、200 mA条件下转膜2~3 h (ATM蛋白转膜6 h)；用含3%脱脂奶粉的TBST溶液4℃封闭2~16 h; 用含3%脱脂奶粉的TBST溶液适当稀释一抗，4℃孵育过夜；用含3%脱脂奶粉的TBST溶液适当稀释二抗，室温孵育1.5 h；用ECL发光试剂盒对PVDF膜蛋白信号曝光显色，ImageQuant350化学发光系统照相保存实验图片。
1.5 统计学处理用Image J图像扫描分析系统分析目标条带的净光密度值，以SPSS13.0统计软件进行One-way ANOVA方差分析。
2 结果 2.1 DDP对MCF-7细胞生长的影响Fig 1结果显示，与对照组 (0 mg·L-1的DDP) 相比较，DDP对MCF-7细胞生长的抑制作用具有浓度依赖性，但最终浓度升高时，抑制作用相对减弱，这可能与细胞产生耐药性有关。本实验测得DDP处理MCF-7细胞48 h的IC50为7.57 mg·L-1。
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| Fig 1 Effect of DDP on cell growth of MCF-7 cell measured by MTT after 48 h (n=3) |
Fig 2结果可见，对照组细胞核呈圆形，淡蓝色，染色质分布均匀，而DDP处理组细胞核固缩，分叶或碎片状 (即凋亡小体出现)，从结果看，顺铂处理组细胞凋亡增加。
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| Fig 2 DDP effect on apoptosis morphology of MCF-7 cell A:NC group; B:DMEM+5% FBS group; C:DMEM+10% FBS group; D:5% glucose group; E:Cisplatin group |
使用DDP药物浓度分别为0、2、4、6、8、10 mg·L-1，处理MCF-7细胞48 h，运用Western blot检测γ-H2AX、ATM、caspase-3、calpain的表达变化。结果显示 (Fig 3~5)，γ-H2AX、ATM、cleaved caspase-3、calpain的表达随DDP浓度升高而增多。
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| Fig 3 Protein expressions related toDNA damage, after MCF-7 cells were treatedwith DDP of different concentrations for 48 h |
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| Fig 4 Protein expressions related tocell apoptosis, after MCF-7 cells were treatedwith DDP of different concentrations for 48 h |
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| Fig 5 Calpain expressions related tocell apoptosis, after MCF-7 cells were treated with DDP of different concentrations for 48 h |
乳腺癌是临床上发病率较高的恶性肿瘤，化疗是众多治疗乳腺癌的重要方式之一[8-9]。DDP是临床治疗肿瘤的广谱抗癌药，DNA是DDP的主要靶点，DDP结合会导致DNA损伤并诱发细胞凋亡。DSBs是DNA损伤的重要表现形式之一，相关研究表明，γ-H2AX可用于检测DSBs, 与同类方法相比具有较好的实用价值[4]。ATM是DNA损伤的直接感受器，DNA在损伤之后，ATM因自身磷酸化而被迅速激活，即使只有少量的DSBs也会促使ATM发生结构的改变[5]。
本次实验中，DDP处理MCF-7细胞48 h后，随药物浓度升高，γ-H2AX与ATM表达量均升高，造成其损伤，进一步影响了一些基因的表达与蛋白的改变。经7.57 mg·L-1 DDP作用48 h后, 在排除其他培养基相应成分干扰的前提下，Hoechst 33258染色结果显示, MCF-7细胞的细胞核固缩，分叶或碎片状，核内染色质因为浓集而呈亮蓝色，从形态学角度可以知道, 顺铂明显诱导MCF-7细胞发生了凋亡，超过了其自身修复的能力。
Western blot结果显示，不同浓度的DDP作用MCF-7细胞后，作为细胞凋亡必不可少的关键酶cleaved caspase-3被激活，通过caspase级联反应，促使与细胞凋亡相关的重要蛋白降解，从而引起细胞凋亡。细胞内的钙蛋白酶calpain是一类Ca2+依赖性的半胱氨酸蛋白酶，可催化多种底物限制性水解。研究者们多数认为钙蛋白酶与caspase家族共同介导细胞凋亡。有研究发现，钙蛋白酶可以通过水解caspase-7、caspase-10和caspase-12产生活性更强的水解底物，从而促进caspase诱导的细胞凋亡[10]。近来研究也证实了钙蛋白酶可以通过裂解凋亡相关的Bcl-2家族，以及通过水解途径激活其他促凋亡途径物质如CDK5、APAF1、JNK、JUN、FOS等介导细胞凋亡[11]。这与本实验得到的calpain表达量在MCF-7细胞被给予DDP之后随浓度升高而增多相一致，进一步证实了钙蛋白酶calpain与细胞凋亡有关。这提示我们，抑制细胞内calpain的表达可能对于肿瘤的治疗有促进作用，也为研究calpain的功能提供了科学依据。
综上所述，DDP通过诱导乳腺癌MCF-7细胞DNA损伤，上调与细胞凋亡相关的蛋白表达，从而引起细胞凋亡。
( 致谢: 本实验在中南大学湘雅医学院分子生物学研究中心实验室完成。 )
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