2. 江西中医药大学附属医院创伤骨科，江西 南昌 330006
2. Dept of Traumatic Orthopedics, the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006, China
甲氨蝶呤 (methotrexate, MTX) 是最早应用临床并取得成功的抗叶酸制剂，为基本抗肿瘤药物之一。它主要通过抑制二氢叶酸还原酶而阻碍肿瘤细胞DNA的合成，进而抑制肿瘤的生长。作为联合化疗方案中常用的周期特异性药物，大剂量或超大剂量MTX化疗对脑部肿瘤有较好的疗效但低剂量MTX几乎无任何作用[1]。近20多年来，人们发现低剂量的MTX在各种炎症性疾病和自身免疫性疾病的治疗中表现出明显的疗效[2]。由此可见，MTX的药理作用因使用剂量的高低而明显不同，低剂量的抗炎作用机制与高剂量治疗靶向恶性疾病的机制有所差异[3]。由于价格低廉，疗效明显和长期使用的安全性，低剂量MTX已为疾病修饰抗风湿药物，常用于治疗类风湿性关节炎、克罗恩氏病和牛皮癣等炎症性疾病。近期的国际共识推荐MTX作为类风湿关节炎的一线控制病情抗风湿药[4]。脊髓损伤 (spinal cord injury，SCI) 会引起一系列炎症反应。创伤后过度发生的炎症反应在其病理生理过程中占有重要地位。鉴于低剂量MTX在炎症和免疫抑制方面有良好的疗效，以及抗炎在SCI治疗中的重要性，本文总结了低剂量MTX发挥抗炎作用的相关药理机制，为进一步明确低剂量MTX临床应用于SCI治疗提供理论指导。
1 低剂量MTX抗炎作用机制 1.1 抑制JAK/STAT通路酪氨酸激酶信号转导子与转录激活因子通路 (janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT) 传递过程相对简单，主要由酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT三部分组成。该通路可以转导多种细胞因子的细胞内信号，涉及炎症、免疫、细胞凋亡、细胞增殖分化等多种病理生理过程。JAK/STAT是一个转导与人体平衡状态相关的生长因子和细胞因子的信号通路。在典型的JAK/STAT通路，包括如IL-2、IL-6、IL-12等促炎性细胞因子与多种配体结合跨膜受体，结合后导致JAKs活化，即酪氨酸及其细胞内残留受体的活化。过度活化JAK/STAT信号传导通路会导致靶细胞的生物学功能异常活跃，往往会对机体造成严重伤害。因此，负调控JAK/STAT通路对维持机体的稳定性起着重要作用。JAK/STAT通路在SCI、蛛网膜下腔出血、脑肿瘤和脑缺血等多种中枢神经系统疾病中可被激活，与人类自身免疫性疾病密切相关，而且JAKs正在成为治疗免疫介导的疾病的靶点[5]。Thomas等[6]研究表明，低剂量MTX应用可抑制JAK/STAT信号通路的活化，对与JAK/STAT信号通路相关的血液系统恶性肿瘤患者有良好的治疗效果。MTX是一种低成本的JAK/STAT信号通路抑制剂[7]，且MTX对STAT3磷酸化作用不可被叶酸逆转。MTX抑制JAK/STAT信号通路的部分机制是通过影响叶酸的代谢来抑制STATS的磷酸化。因为有叶酸的存在可抑制STAT磷酸化，且MTX与叶酸有相同的转运途径。MTX可能是通过降低细胞内药物的浓度，或者降低JAK/STAT信号通路相应配体的生理刺激水平而降低该信号通路的活性，从而发挥细胞药物的治疗作用。综上所述，抑制JAK/STAT信号通路可能是低剂量MTX发挥抗炎和免疫抑制作用的重要机制之一。
1.2 抑制炎症反应和免疫反应炎症反应时，一些来自血液和单核巨噬细胞系统的炎症细胞集中于炎症病灶，参与炎症反应和免疫反应。低剂量MTX可以抑制细胞增殖和组胺等炎症介质的反应发挥很强的抗炎作用。在炎症和免疫反应中，如TNF和IL-1等细胞因子作为起主要作用的信使，正在成为治疗慢性关节炎的重要靶向目标[8]。类风湿关节炎是以免疫功能紊乱为特征的自身免疫性疾病，会造成关节滑膜炎症反应。MTX可纠正类风湿关节炎患者免疫功能异常，缓解炎症反应，减轻自身免疫反应所造成的关节软骨破坏。有研究表明MTX可抑制单核细胞中产生IL-1，而不是降低血清中的IL-1[9]。滑膜和全身系统性炎症与大量可溶性介质的变化有关。这些介质包括脂质衍生物如前列腺素、白三烯和血小板活化因子、补体活化产物、细胞因子、趋化因子和生长因子等。低剂量MTX治疗可以直接影响这些因子的合成或降解，或间接改变这些介质所介导的细胞反应。低剂量MTX可以抑制炎症反应细胞核因子-κB (NF-κB) 的活性，进而抑制细胞因子粘附分子和趋化因子等多种炎症介质的释放，阻断炎症细胞活化及其粘附在组织中的聚集，抑制诱生型一氧化氮合成酶，使炎症反应得以控制[10]。MTX具有很强的免疫抑制作用，它能选择性的作用于增殖中的细胞，阻止免疫母细胞的进一步分裂增殖，产生体液免疫和细胞免疫作用[11]。MTX可与二氢叶酸还原酶结合，阻止二氢叶酸还原为活泼的四氢叶酸，阻断脱氧核糖核酸及核糖核酸的合成。由于核蛋白合成较少，故可抑制细胞增殖和复制，这是低剂量MTX可以抑制过度的自身免疫现象的原因。在胶原诱导的小鼠关节炎模型中，低剂量MTX特异性调节由T细胞和巨噬细胞产生的细胞因子[12]。
1.3 增加腺苷的积累腺苷介导的抗炎作用在低剂量MTX的抗炎机制中占有非常重要的地位[13]。MTX可以抑制淋巴细胞中腺苷的脱氨基作用，增强腺苷诱导的血管舒张功能。低剂量MTX应用可促进炎症部位细胞外腺苷的释放，增加腺苷的累积从而发挥抗炎作用。MTX通过对二氢叶酸还原酶的竞争性抑制，减少嘌呤和嘧啶的从头合成，阻止产生有活性的四氢叶酸而抑制DNA的生物合成。MTX通过抑制二氢叶酸还原酶，抑制由蛋氨酸和S-腺苷甲硫氨酸产生的有淋巴毒性的多胺，降低四氢叶酸和甲基四氢叶酸的甲基供体水平。MTX通过抑制5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸 (5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide, AICAR) 甲酰转移酶，并进一步抑制腺苷酸脱氨酶，降低腺苷酸和腺苷分别分解代谢成肌苷酸和肌苷。这一系列反应最终导致了腺苷的积累，由此带来MTX的抗炎特性。
腺苷是由嘌呤核苷酸的磷酸化作用生成的一种嘌呤核苷，通过腺苷受体对中枢神经系统 (central nervous system，CNS) 有多方面的生理与病理作用，被认为是CNS的抑制性神经递质。腺苷及其受体作为炎症反应的反馈调节作用已经确立。它能够抑制中性粒细胞和单核细胞的趋化作用，发挥抗炎作用[14]。细胞外腺苷可以和细胞表面的不同跨膜腺苷受体 (如A1、A2α、A2β及A3受体) 相结合，产生不同的生物学效应。目前研究认为，腺苷与腺苷受体A2、A3的结合可使炎症细胞产生免疫抑制作用。腺苷与巨噬细胞膜上的A2α受体结合，导致细胞内环磷酸腺苷分泌增多，从而抑制巨噬细胞的吞噬作用，并抑制前炎症因子TNF、γ-干扰素 (Interferon-γ，IFN-γ)、IL-2、IL-12的分泌及基因表达，同时可促进抗炎因子IL-6、IL-10的分泌。腺苷与淋巴膜上的A2α、A3受体结合也可抑制淋巴细胞的增殖并减少其分泌TNF、IL-8、IL-12及IFN-γ[15]。中性粒细胞的活化是急性炎症反应的细胞标志之一，会产生超氧阴离子等氧自由基，诱导细胞损伤。而腺苷可以抑制中性粒细胞的激活和趋化，进而减少受刺激的中性粒细胞产生的氧自由基和其它有害的介质。中性粒细胞粘附于内皮细胞，可以被一定的腺苷受体亚型激活，也可被其它类型的腺苷受体抑制[16]。被TNF激活的中性粒细胞释放血管内皮生长因子，并被诱导迁移穿过血管内皮，增加炎症环境下血管通透性。而腺苷可以抑制中性粒细胞的上述活动，改变中性粒细胞粘附分子 (如L-选择素、β2整合素) 的表达能力[17]。激活的中性粒细胞也可以释放5′-单磷酸腺苷。当5′-单磷酸腺苷去磷酸化为腺苷，直接增强细胞内皮的屏障功能[18]。
1.4 细胞内MTX代谢产物作用MTX存在细胞内代谢，当它进入体内后，其在血浆中的浓度迅速下降，其主要成分通过还原性叶酸载体进入细胞内，在多聚谷氨酸合成酶的作用下转化为多聚谷氨酸化甲氨蝶呤发挥治疗作用。多聚谷氨酸化甲氨蝶呤在细胞内可蓄积长达1个月甚至数月，之后多聚谷氨酸化甲氨蝶呤则在γ-谷氨酰转肽酶作用下重新转化为MTX后离开细胞[19]。大量研究表明，多聚谷氨酸化甲氨蝶呤的浓度与MTX治疗类风湿关节炎的疗效关系极为密切[20]，且白血病细胞内多聚谷氨酸化甲氨蝶呤的含量与治疗结果密切相关。高剂量MTX治疗时细胞内多聚谷氨酸化甲氨蝶呤含量明显高于低剂量时，并与血药浓度呈正相关。多聚谷氨酸化甲氨蝶呤与MTX的治疗作用关系极为密切且与其具有相同的药理作用：抑制二氢叶酸还原酶，阻碍DNA、RNA及部分蛋白质的合成；抑制T和B淋巴细胞，抑制致炎因子，抑制中性粒细胞和单核细胞趋化作用[21]。多聚谷氨酸化甲氨蝶呤是AICAR的有效抑制剂，阻碍AICAR转化为甲酰化AICAR。AICAR能够抑制腺苷脱氨酶，减少腺苷的降解，增加细胞内腺苷的浓度。随着细胞内腺苷和5-P的增加，它们会进入细胞外环境。在胞外环境，5-P腺苷转化为腺苷，优先与A2α受体结合。结合后，促使胞内环磷腺苷水平增加，高水平cAMP产生一系列抗炎效应，如减少TNF、TNF-γ、IL-12、IL-6的分泌，抑制吞噬作用[22]。
2 低剂量MTX对脊髓损伤的治疗作用SCI引起的一系列炎症反应会导致脊髓组织内和浸润的炎症细胞释放大量的促炎症介质和神经毒素，产生氧自由基和亚硝基复合物导致细胞损害，进而产生神经功能障碍。继发性SCI是在原发性损伤基础上发生的多种信号通路参与的一系列生理生化反应，如氧化应激、炎症反应、脊髓缺血/再灌注损伤等。MTX以往作为抗炎药和抗肿瘤药应用于临床，近年来的研究发现其可在SCI修复过程中发挥神经保护作用。低剂量MTX可通过抗炎和抗氧化等作用控制损伤进程的发展，影响神经细胞凋亡进程。大剂量甲强龙 (Methylprednisolone，MP) 冲击治疗的时间窗短是目前其应用于临床的一大弊端，低剂量MTX作为抗炎药长期临床应用已证实了其给药时间具有灵活性，且低剂量药物治疗副作用相对较小。
2.1 抑制继发性炎症反应, 减轻炎症损伤炎症反应是损伤后机体与致炎因子相抗争的过程，具有保护组织和促进损伤进程的双重作用。一方面，免疫系统被激活后可清除坏死细胞，使受损组织和创面得到修复；另一方面，由于损伤后血脑屏障被破坏导致中性粒细胞和巨噬细胞等向损伤部位大量迁移，炎性细胞在吞噬细胞碎片的同时释放蛋白酶和氧自由基等神经毒性物质，造成细胞膜损伤并引起神经元及胶质细胞凋亡，参与形成胶质瘢痕过程。SCI早期炎症反应是一个综合的过程，涉及固有小胶质细胞、巨噬细胞、小胶质细胞和树突细胞的浸润。SCI早期中性粒细胞迅速进入损伤区域，并在24 h达到峰值，活化的中性粒细胞和巨噬细胞通过释放细胞因子、自由基、花生四烯酸和蛋白酶产生神经细胞毒性[23]。研究表明在损伤情况下，CNS细胞包括小胶质细胞可产生促炎性细胞因子，而中性粒细胞的活化和聚集正是受这种细胞因子调控。低剂量MTX减少了损伤部位的中性粒细胞数，减少合成有毒性促炎性细胞生长因子，能降低促炎性因子表达, 减轻炎症反应[24]。虽然其确切的作用机制尚未澄清，低剂量MTX促进细胞外炎症部位的腺苷积累是其可能机制。腺苷与其受体相互作用 (腺苷A2受体) 刺激炎性细胞，抑制一些细胞因子如IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IFN-γ、白三烯、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等的分泌及基因表达。腺苷也能抑制超氧化物、一氧化氮和由单核细胞和巨噬细胞释放TNF。腺苷通过抑制被刺激的中性粒细胞与内皮细胞粘附产生的有毒氧代谢产物而发挥其保护细胞的作用。
2.2 降低脂质过氧化物水平，抑制氧化反应氧化应激是损伤机体活性氧的过量产生超出了机体自身抗氧化能力，而导致氧化产物积累，对损伤组织造成破坏的过程。它是脊髓继发性损伤过程中的一种主要参与机制。由于脂质、蛋白质和核酸等生物大分子易被过量的活性自由基氧化，改变自身的分子结构和活性，破坏细胞膜及线粒体的功能，最终导致细胞的死亡[25]。已报道低剂量MTX可在多种疾病发展过程中降低自由基产生，从而达到抑制损伤程度扩大的治疗效果[26-27]。CNS损伤后产生大量的乳酸和谷氨酸等，为氧化反应发生提供了合适的酸环境，使CNS内含有的大量不饱和脂肪酸发生氧化，生成MDA、HNE等活性醛类化合物，以及类二十烷酸化物[28]。Sanli等[24]报道大鼠脊髓挫伤后24 h使用低剂量MTX治疗，能够明显减轻急性炎症早期的嗜中性粒细胞浸润和相关的脂质过氧化损伤。Bakar等[29]研究表明，在大鼠脊髓压迫损伤后5 d，结合低剂量MTX的MP治疗与单纯的MP治疗相比更能降低损伤组织的脂质过氧化水平。由于大量基质金属蛋白酶、活性氧以及中性粒细胞释放的TNF，导致中性粒细胞和固有细胞 (指神经元和神经胶质细胞) 的接触，从而增加固有免疫细胞的毒性。SCI后，损伤部位的髓鞘退化可导致髓鞘碎片，可抑制树突细胞祖细胞成熟，脱髓鞘可导致轴索变性和损失。此外，轴索变性可导致损伤远端出现胶质增生。透射电镜观察比较受伤和未受伤脊髓超微结构的变化，发现低剂量MTX对细胞器有明显的保护作用，特别是对含有髓鞘的轴突和线粒体。低剂量MTX在大鼠SCI亚急性期降低脂质过氧化物水平，且在继发性SCI中有着优于MP的治疗作用[30]。
2.3 减轻脊髓缺血/再灌注损伤，减轻神经性疼痛脊髓缺血/再灌注损伤是涉及细胞凋亡、脂质过氧化、自由基生成增加、细胞内钙超载、兴奋性毒性产物增加等多个方面的病理生理过程，可导致神经元的损伤，加剧继发性损伤。细胞凋亡是由体内外某些因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞主动死亡方式。目前，治疗脊髓缺血/再灌注损伤最常用是类固醇激素的抗炎作用，如MP可以减轻细胞凋亡，在SCI中表现出有意义的神经保护作用。短暂缺血之后，组织细胞和血管内皮细胞释放出腺苷，腺苷通过激动腺苷受体调节细胞代谢，对随后的缺血损伤产生保护作用，即发挥缺血适应性作用。Kertmen等[31]研究证实，低剂量MTX可以通过减轻炎症、脂质过氧化、氧化应激和抑制细胞凋亡等作用，保护脊髓的正常组织形态和超微结构，改善运动神经功能, 可以有效治疗兔脊髓缺血/再灌注损伤。因此，低剂量MTX已被证明对脊髓缺血/再灌注损伤至少和MP一样有效，为进一步应用于SCI后有前途的药物。低剂量MTX也可以通过限制梗死面积保护心脏缺血/再灌注损伤。小胶质细胞 (microglial cell，MG) 的激活对神经损伤后疼痛的产生至关重要。激活的MG可以释放一系列神经活性物质，如神经生长因子和NO等增强痛觉的物质并引发疼痛。阻断脊髓MG活化可抑制或减轻多种疼痛增强免疫反应。这些从MG释放的神经活性物质作用于脊髓背角的痛觉传递神经元使其处于敏化状态。同时，活化的MG也可释放TNF、IL-6等前炎性细胞因子。激活的MG可释放脑源性神经营养因子，作为MG与神经元之间的一个关键信号蛋白，通过分布在脊髓后角第一层的TrkB受体 (酪氨酸激酶受体，BNDF特异性受体)，除极化改变氯离子在神经细胞膜两边的分布。这可导致激发抑制性氨基酸类递质γ-氨基丁酸，从而引起疼痛。在神经病理性疼痛中，RhoA/rock通路介导p38 MAPK活化和脊髓小胶质细胞P2Y12/13受体下端形态学的改变[32]。Schol等[33]研究发现神经损伤后早期鞘内注射MTX，以不引起毒副作用的剂量可以降低脊髓组织小胶质细胞的活化，减少p38磷酸化，进而减少大鼠神经性疼痛行为。因此，低剂量MTX在周围神经病理性疼痛模型上具有免疫抑制和镇痛作用。
此外，低剂量MTX还与抑制神经细胞凋亡，修复SCI有其它间接相关联的机制，有待进一步深入细致的研究。JAK-STAT信号通路与神经再生和损伤区胶质瘢痕的形成有关。该通路在神经保护中的作用主要通过调节神经干细胞分化和神经祖细胞增殖，刺激反应性星形胶质细胞分泌多肽[34]。JAK2/STAT3信号通路的激活参与了大鼠SCI后的继发性损伤，而凋亡被认为是SCI导致神经元死亡的主要机制之一[35-36]。因此，低剂量MTX可能通过JAPK2激酶调节STAT3蛋白的磷酸化达到抑制细胞凋亡，从而对SCI起到神经保护作用。腺苷以腺苷三磷酸 (ATP) 或腺苷二磷酸 (ADP) 形式转移能量，是用于合成三磷酸腺苷 (ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。在大鼠体内三磷酸腺苷通过激活mTOR/STAT3信号通路，诱导内源性神经干细胞增殖、分化为神经元，促进大鼠SCI修复[37]。临床长期使用低剂量MTX可引起血及尿中尿酸水平增高[38]。尿酸是人体内一种很重要的抗氧化剂、铁螯合剂、自由基清除剂，并且可作为一种中枢神经系统抗氧化剂而减轻继发性SCI[39-40]。这可能提示：低剂量MTX治疗在产生免疫调节和抗炎疗效的同时，也提高了内源性尿酸的水平，需要更进一步深入的研究。
3 结语综上所述，低剂量MTX通过对JAK/STAT通路和抑制炎症反应和免疫反应、增加腺苷的积累及细胞内甲氨蝶呤代谢产物 (多聚谷氨酸化MTX) 的作用等发挥抗炎功效。此外，低剂量MTX可以降低脂质过氧化物水平、抑制氧化反应，抑制继发性SCI的炎症反应，减轻脊髓缺血/再灌注损伤和神经性疼痛等一系列药理机制产生神经保护作用。临床高剂量MTX可以作为化疗药物治疗各种不同类型白血病等顽固性疾病的治疗，而低剂量MTX可以治疗血管炎等[41]累及中枢神经系统的炎症性疾病。因此，价格低廉的低剂量MTX有望成为治疗SCI的潜在药物之一。目前，国内外对于大剂量MTX治疗肿瘤的药动学研究较多，但关注小剂量MTX治疗自身免疫疾病相关的药动学较少。如何取得MTX药物治疗的最佳疗效将是低剂量MTX直接应用于临床有待解决的问题。
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