糖尿病状态下，某些CYP450酶亚型的功能与表达水平发生变化，导致其底物药物的药代动力学发生相应的改变，从而影响药物疗效或导致不良反应的发生[1-2]。CYP1A2是CYP450家族的重要成员之一，主要在肝脏表达，参与多种内源性底物和药物的代谢，以及多种前致癌物的激活与灭活，具有重要的药理学和毒理学意义。有文献报道，化学诱导的糖尿病大鼠肝脏中CYP1A2的蛋白表达和mRNA水平与对照组相比均明显增加[3-5]，从而影响了CYP1A2的底物如茶碱、氨基比林等药物的药代动力学，使得AUC下降，清除加快，同时其代谢物水平也发生改变。糖尿病对肝脏CYP1A2的影响同样在糖尿病患者中发现，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者服用安替比林和茶碱等药物后，清除率均有所增加[6-7]。
糖尿病上调肝脏CYP1A2的功能与表达，然而其作用机制尚未明确。糖尿病状态下，体内激素分泌及代谢功能紊乱，很多指标如胰岛素、葡萄糖、脂肪酸等水平都发生明显改变。有研究显示，脂肪酸对代谢酶的功能或表达产生影响。长期给予大鼠食用不饱和脂肪酸可增加大鼠肝脏CYP1A2 mRNA表达水平和酶活性[8]。然而，体外微粒体实验显示，不饱和脂肪酸抑制CYP1A2的酶活性，而饱和脂肪酸对其无影响[9]。在体研究受到多种因素的干扰，较难明确某种单独因素的影响，而体外细胞实验可以相对减少其他因素的影响。我们前期研究发现，脂肪酸可诱导体外培养的肝细胞上CYP3A酶活性与表达[10]，然而，在体外肝细胞上研究脂肪酸对CYP1A2功能与表达的影响，目前国内外相关报道较少。因此，本研究通过体外考察脂肪酸对肝细胞上CYP1A2功能与表达的影响，初步探索糖尿病状态下肝脏CYP1A2的变化机制。
1 材料与方法 1.1 仪器超净工作台(美国Thermo公司)；灭菌锅(上海医用原子核仪器厂)；Milli-Q Gradient A10超纯水机(美国Millipore公司)；万分之一和十万分之一电子天平(日本Shimadzu)；台式冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司)；GENIE VORTEX-2涡旋混匀装置(美国Scientific Industries公司)；Synergy2荧光酶标仪、PowerWave X紫外/可见光酶标仪(美国Bio-tek公司)；超声破碎仪(日本三洋公司)；岛津高效液相色谱仪：SCL-10A系统控制器，SIL-10AD vp自动进样器，LC-10AT泵，CTO-10A柱温箱，RF-10A XL荧光检测器；HW-2000色谱工作站2.12版(南京千谱软件有限公司)。
1.2 试剂油酸(oleic acid，OA)、亚油酸(linoleic acid，LA)、软脂酸(palmitic acid，PA)、硬脂酸(stearic acid，SA)、胰岛素、链脲菌素(美国Sigma公司)；高糖DMEM培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(PAA, Austria)；非必需氨基酸、胰蛋白酶消化液(型号25200，澳大利亚Gibco公司)；考马斯亮蓝G-250、MTT (美国Amersco公司)；无脂肪酸牛血清白蛋白(上海前尘生物科技有限公司)；MFE Support Medium F、MFE Plating Medium F (美国XenoTech公司)；Ⅰ型鼠尾胶原(型号354236，美国BD公司)；水为超纯水；甲醇和乙腈(美国Merck公司)；其他试剂均为国产分析纯。
1.3 动物♂ SD大鼠，体质量100~200 g，由上海斯莱克动物实验动物中心提供，许可证号：SCXK (沪)2012-0002。
1.4 细胞培养HepG2细胞购自上海中科院细胞库。将细胞消化后，分散于T-75培养瓶中，用高糖DMEM培养基于37 ℃、含5% CO2(相对湿度90%) 的环境中培养，2~3 d更换1次培养基。
超低温冷冻无限增殖化肝细胞Fa2N-4购自美国XenoTech公司。Fa2N-4细胞培养：24孔板中每孔加入4%的胶原溶液，培养箱中放置3~4 h后，吸出上层溶液换成PBS待用。细胞复苏后，混悬于MFE Plating Medium F中，细胞计数后，将细胞悬液(0.67×109 cells·L-1) 点板至铺好胶的24孔板，每孔加入0.5 mL。在培养箱中培养3~6 h后，将MFE Plating Medium F吸出，换成MFE Supporting Medium F继续培养，并每隔24 h换液1次。Fa2N-4细胞点板后d 5加药，将药物溶解在MFE Supporting Medium F中，每24 h换液1次，诱导48 h后，测定酶活性和表达。
1.5 细胞中CYP1A2的活性测定将CYP1A2的底物药物非那西丁与细胞共孵育，通过测定其代谢物对乙酰氨基酚的生成量来考察CYP1A2的活性。首先，对非那西丁在本实验所用HepG2细胞上代谢的时间依赖性和浓度依赖性进行考察。每孔细胞用1 mL的HBSS溶液在37 ℃下温孵15 min，除去细胞表面杂质。吸去HBSS溶液后，每孔加入含非那西丁500 μmol·L-1的HBSS液1 mL，在37 ℃下分别温孵30、60、120、240、300 min。或者每孔分别加入含非那西丁20、50、100、200、500 μmol·L-1的HBSS溶液1 mL，37 ℃温孵120 min。吸出HBSS温孵液，测定生成的代谢物含量。每孔加入1 mL超纯水，反复冻融3次，超声破碎细胞，通过考马斯亮蓝法测定细胞中蛋白含量。
细胞样品处理：取500 μL温孵液，加入1 mL乙酸乙酯，涡旋振荡3 min，离心(8 000 r·min-1, 10 min), 取上层800 μL，真空挥干，100 μL流动相复溶，离心(20 000 r·min-1, 10 min)，取上清进样。HPLC条件[11-12]：色谱柱为C18柱(Phenomenex, 150 mm×4.6 mm, 5 μm)；检测波长: 254 nm；灵敏度0.01 AUFS；柱温40 ℃；流动相为甲醇:水(30 :70)，流速1 mL·min-1；进样量20 μL。
1.6 细胞中CYP1A2 mRNA的表达使用荧光染料SYBR GreenⅠ进行定量PCR分析。CYP1A2和β-actin的引物序列分别为：CYP1A2 forward：5′-CCCAGAATGCCCTCAACACC-3′，CYP1A2 reverse：5′-CCTTAGCCTCCTTGCTCACA-3′；β-actin forward：5′-CAGTCGGTTGGAGCGAGCAT-3′，β-actin reverse：5′-GGACTTCCTGTAACAACGCATCT-3′。qPCR结果根据文献[13]计算。
1.7 糖尿病大鼠模型的建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型：♂ SD大鼠，体质量180~200 g。腹腔注射大剂量STZ (65 mg·kg-1) 诱导Ⅰ型糖尿病大鼠[14]。7 d后，用葡萄糖试剂盒测定大鼠的空腹血糖，空腹血糖高于11.1 mmol·L-1的大鼠选入糖尿病模型组，对照组和糖尿病组大鼠再同时饲养4周，收集血清。Ⅱ型糖尿病大鼠模型：♂ SD大鼠，体质量100~110 g，腹腔注射小剂量STZ (35 mg·kg-1) 结合高脂饮食诱导Ⅱ型糖尿病大鼠[15]，造模确认成功后第4周收集血清。
1.8 糖尿病大鼠血清对HepG2细胞上CYP1A2功能的影响取造模成功的糖尿病大鼠血清和对照组正常大鼠血清。将血清于56℃灭活30 min，并用0.22 μm滤膜过滤除菌，分别用灭活除菌后的100%糖尿病大鼠血清和100%对照大鼠血清培养融合成单层的HepG2细胞，培养48 h后，测定HepG2细胞上CYP1A2的功能。
1.9 脂肪酸对细胞上CYP1A2功能和表达的影响将HepG2细胞传代于24孔板中，待细胞长满至80%左右时将其分组，分别用正常培养基和加入100、200 μmol·L-1的OA、LA、PA和SA的培养基培养48 h后，对细胞上CYP1A2的功能或表达进行检测。Fa2N-4细胞点板后d 5，分别用正常培养基和含200 μmol·L-1的OA、LA、PA和SA的培养基培养48 h后，对细胞上CYP1A2的功能或表达进行检测。
1.10 统计学分析数据均用x±s表示，采用SPSS 16.0统计软件进行分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。
2 结果 2.1 非那西丁在HepG2细胞上的代谢非那西丁在HepG2细胞中可生成代谢物对乙酰氨基酚。如Fig 1所示，随着孵育时间和底物浓度的增加，代谢物的生成也逐渐增加。通过非那西丁的浓度依赖性和时间依赖性代谢实验，说明本实验中所用的酶活性测定方法是可行的。对下述细胞上CYP1A2活性测定实验，选择500 μmol·L-1底物浓度，孵育时间2 h。
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| Fig 1 Effect of serum from diabetic ratson CYP1A2 activity in HepG2 cells |
用STZ造模成功的Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病大鼠血清培养HepG2细胞，对照组用正常大鼠血清培养细胞，48 h后，通过非那西丁的代谢物生成考察CYP1A2的功能。结果显示，用糖尿病大鼠血清培养的HepG2细胞中非那西丁的代谢明显增加(Fig 2)。与正常大鼠血清培养的HepG2细胞相比，Ⅰ型糖尿病大鼠血清培养的细胞上对乙酰氨基酚的生成速率增加50%(Fig 2A)，Ⅱ型糖尿病大鼠血清培养的细胞上对乙酰氨基酚的生成速率增加了277%(Fig 2B)。表明糖尿病大鼠血清培养的HepG2细胞上CYP1A2的功能增强。
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| Fig 2 Effect of serum from diabetic ratson CYP1A2 activity in HepG2 cells A:Serum of type 1 diabetes; B:Serum of type 2 diabetes.**P < 0.01 vs Con |
将不同浓度的脂肪酸，包括饱和脂肪酸PA和SA，以及不饱和脂肪酸OA和LA，与HepG2细胞共培养48 h，考察脂肪酸对HepG2细胞上CYP1A2的功能的影响。结果显示，高浓度的脂肪酸均能浓度依赖性地增加对乙酰氨基酚的生成(Fig 3)。与对照组相比，200 μmol·L-1的PA、SA、OA和LA分别增加了HepG2细胞49%、92%、55%和24%的CYP1A2酶活性(Fig 3)。
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| Fig 3 Effects of fatty acids on CYP1A2 activity in HepG2 cells A:Oleic acid; B:Linoleic acid; C:Palmitic acid; D:Stearic acid.*P < 0.05, **P < 0.01 vs Con |
qPCR结果显示(Fig 4)，2种脂肪酸OA和PA均能上调CYP1A2的mRNA水平。OA培养的HepG2细胞中CYP1A2的mRNA水平约为对照组的5.7倍，而PA培养的HepG2细胞中CYP1A2的mRNA水平约为对照组的11.4倍。
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| Fig 4 Effects of fatty acids on CYP1A2mRNA expression in HepG2 cells *P < 0.05 vs Con |
在另外一种肝细胞Fa2N-4上考察脂肪酸对CYP1A2的影响。结果与HepG2细胞类似，4种脂肪酸OA、LA、PA、SA均能不同程度增加CYP1A2的活性(Fig 5)。200 μmol·L-1的OA、LA、PA、SA作用于Fa2N-4细胞48 h后，对乙酰氨基酚的生成与对照组相比分别增加了47%、35%、15%、25%。
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| Fig 5 Effects of fatty acids on CYP1A2 activity in Fa2N-4 cells *P < 0.05, **P < 0.01 vs Con |
qPCR结果显示(Fig 6)，4种脂肪酸OA、LA、PA、SA也均能上调Fa2N-4细胞CYP1A2的mRNA水平。
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| Fig 6 Effects of fatty acids on CYP1A2 mRNAexpression in Fa2N-4 cells *P < 0.05, **P < 0.01 vs Con |
糖尿病动物和糖尿病患者肝脏CYP1A2功能与表达水平均明显增高，机制尚不明确。糖尿病状态下，体内激素分泌及代谢功能均发生紊乱，影响代谢酶的因素较多，因此很难在体研究单一因素对代谢酶的影响。有多篇文献报道，可通过用糖尿病血清培养离体细胞，如内皮细胞、胚胎细胞等，体外模拟糖尿病环境，研究糖尿病对细胞的影响[16-17]，故本研究尝试将肝细胞与糖尿病血清共培养，并在体外细胞水平上研究糖尿病影响肝细胞上CYP1A2的作用机制。结果发现，糖尿病血清培养的HepG2细胞上CYP1A2的功能明显增加，与在体实验结果一致。
与正常血清相比，糖尿病血清中很多指标，如胰岛素、葡萄糖、脂肪酸等水平均发生明显变化。链脲菌素诱导的糖尿病大鼠血清中脂肪酸水平明显增加，其中OA、LA、PA和SA在Ⅰ型糖尿病大鼠血清中的浓度分别为正常大鼠的4.5倍、3.5倍、2.4倍、3.5倍[10]。此外，各脂肪酸在Ⅱ型糖尿病大鼠血清中的总量是正常大鼠的3.0倍[18]。前期研究结果提示脂肪酸可诱导肝细胞上CYP3A酶活性和表达，因此，在本研究中我们考察脂肪酸对肝细胞上CYP1A2的影响。结果发现脂肪酸，无论是饱和脂肪酸还是不饱和脂肪酸，均可增加人肝癌细胞HepG2上CYP1A2的活性与表达，同时，该结果也在另一种人永生化肝细胞Fa2N-4上得到了进一步的验证。
CYP1A2酶活性或表达在伴有脂质代谢紊乱的疾病状态下均发生改变(如糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝等)[19-20]。很多在体和离体的研究也表明，脂质代谢紊乱对CYP1A2的功能表达具有一定影响。有研究显示，大鼠长期食用二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸，肝脏CYP1A2 mRNA表达水平和酶活性增加[8]。高酮体血症大鼠肝脏CYP1A2明显增加[21]。然而，体外研究显示出相反的结果，5种不饱和脂肪酸，亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸均可抑制肝微粒体中CYP1A2的酶活性，而饱和脂肪酸软脂酸和硬脂酸对CYP1A2的酶活性无影响[9]。人原代肝细胞暴露在高浓度(1、2 mmol·L-1) 的脂肪酸(油酸和软脂酸2 :1混合)14 h后，CYP1A2的活性和mRNA表达明显降低[22]。而本研究的结果与在体研究的结果是一致的，这可能是由于脂肪酸浓度和共培养时间不同所导致。高浓度的脂肪酸会使细胞中的脂质聚集并导致细胞凋亡，故无法长时间与细胞共培养。然而，疾病引起的脂质紊乱对肝细胞上功能蛋白的调节是一个长期的过程，这提示选择合适的脂肪酸浓度和培养时间，是体外模拟疾病状态及研究脂肪酸对细胞影响所需关注的问题之一。有文献报道，脂肪酸影响转录因子水平[23]，而后者也是调控CYP450酶的重要因素之一，脂肪酸对CYP1A2功能和表达的影响是否是通过以上通路或由相关信号通路介导的，还有待进一步深入研究。
本研究在体外细胞水平上对糖尿病状态下肝脏CYP1A2变化机制进行了初步探索，发现脂肪酸浓度的异常变化可能是影响肝脏CYP1A2的功能和表达改变的部分原因，为进一步探索糖尿病状态下肝脏CYP1A2改变机制的研究提供了一定的基础。
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