2. 南华大学生物技术系，湖南 衡阳 421001;
3. 常德市职业技术学院医学系，湖南 常德 415000
2. Dept of Biotechnology, University of South China, Hengyang Hunan 421001, China;
3. Dept of Medicine, Changde Vocational Technical College, Changde Hunan 415000, China
烟酸(niacin) 又称维生素B3或尼克酸，具有重要的生理作用，然而，让它备受关注的是其调脂作用[1]。早在20世纪60年代，烟酸就作为调脂药物开始应用于临床[2]。研究表明[2-3]，烟酸通过影响Apo AI、CETP、ABCA1的表达，进而调节HDL-C水平。在药理剂量下，烟酸是最有效的升高血浆HDL含量的调脂药物，同时能降低血浆低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol, LDL)、脂蛋白a (lipoprotein a, Lip a) 以及甘油三酯(triglycerides, TG) 等的含量，具有预防和治疗心血管疾病的作用[4-5]。作为既能升高HDL，又能降低LDL的调脂药物，烟酸升高HDL的作用已被广泛认可，但是其降低LDL的作用及机制却有待完善。
血浆高LDL-C水平是心血管疾病(cardiovascular disease, CVD) 的危险因素之一[6]。超过70%的血浆LDL-C通过LDLR途径经肝细胞代谢[7]。而LDLR的表达同时受到固醇调节元件结合蛋白2(sterol regulatory element binding proteins 2, SREBP2) 等因子的转录水平调节[8]，又受到前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9) 等因子的转录后调节[9]。SREBP2是存在于内质网上的固醇敏感器，当细胞内胆固醇水平处于失平衡状态时，它能相应调节下游靶基因LDLR及PCSK9等因子的表达[10-11]。PCSK9蛋白成熟体则能与LDLR的EGF-A区域结合，并诱导LDLR进入溶酶体降解[12]。为证实烟酸是否通过调节SREBP2和PCSK9的表达而降低LDL-C水平，本研究运用烟酸作用HepG2细胞，检测调控LDLR的相关因子的表达变化，试图寻找烟酸的新的降血浆LDL-C的机制。
1 材料与方法 1.1 细胞与试剂人肝癌细胞系HepG2购自中国科学院细胞生物学研究所上海细胞库。烟酸购自Biosharp公司；人源性LDL购自广州弈源公司；人源性缺脂蛋白血清(human lipoprotein-deficient serum, LPDS) 购自美国Biomedical Technologies Inc.公司；油红O和DMSO购自Amresco公司；苏木精购自博士德生物公司；组织总胆固醇/游离胆固醇酶法测定试剂盒(E1015/E1016) 购自北京普利莱基因技术公司；25-羟胆固醇(25-HC) 购自美国Sigma公司；总RNA提取试剂盒(TRIzon Reagent) 购自康为世纪生物科技有限公司；Donkey anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 647)、兔抗人LDLR和PCSK9抗体购自美国Abcam公司；兔抗人β-actin购自美国CST公司；山羊抗人的SREBP2抗体购自美国R&D公司；辣根过氧化物酶标记的二抗：山羊抗兔和兔抗山羊均购自上海优维宁生物科技公司。其余试剂均为国产分析纯。
1.2 药物配制烟酸工作液：DMSO配制成400 mmol·L-1的母液，胎牛血清稀释，0.22 μm滤器过滤分装，-20℃避光保存。
1.3 实验分组油红O染色以及胆固醇含量测定实验分组为：① Basal; ② Control; ③ Niacin 300 μmol·L-1; ④ Vehicle 0.075% DMSO)；其中②~④组加入25 mg·L-1 LDL。
在溶媒对实验无影响的情况下，调整分组为：① Basal; ② Control; ③ LPDS (10%); ④ 25-HC (10 mg·L-1); ⑤ Niacin 300 μmol· L-1；其中②~⑤组加入25 mg·L-1 LDL。
1.4 油红O实验细胞培养至对数生长期，1×105个细胞/孔接种至预先放置好无菌盖玻片的6孔板内，培养24 h，药物孵育24 h。多聚甲醛固定30 min，油红O染色约7 min，苏木精染色约4 s，甘油封片，观察并拍照。
1.5 酶法测定胆固醇含量细胞培养至对数生长期，1×105个细胞/孔接种至6孔板培养24 h，药物孵育24 h。收集细胞裂解液，离心，取上清。按照总胆固醇含量酶法测定试剂盒(E1015/E1016) 的说明书操作，37℃水浴20 min后，酶标仪测定A570胆固醇含量。BCA试剂盒测定的细胞内总蛋白含量用以标化各样本的胆固醇值，标化后的胆固醇浓度单位为总胆固醇(游离胆固醇)/蛋白=μmol·g-1。
1.6 细胞表面LDLR含量流式检测对数期生长的HepG2以1×105个细胞/孔接种至6孔板内培养24 h，药物孵育24 h。收集细胞，PBS洗涤，0.50% BSA封闭，抗体孵育及洗涤。FL3 emission filter流式细胞仪检测，Cell Quest Pro software (BD Biosciences) 分析对比各组与Control的平均荧光强度。
1.7 mRNA含量检测对数期生长HepG2细胞以1×106个细胞/孔接种至50 mL培养瓶，培养24 h，药物孵育24 h。根据TRIzon Reagent说明书提取总RNA。紫外分光光度仪测定OD260/OD280比值介于1.9~2.1；琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性，28S rRNA、18S rRNA条带清晰可见，提取的总RNA可用于后续实验。
根据逆转录试剂盒说明书操作，取2 μg总RNA逆转录合成cDNA，PCR扩增条件为：42℃、30 min，85℃、10 min；再取2 μg逆转录产物进行qPCR，反应体系为20 μL。引物由上海诺伦生物医药技术有限公司设计与合成(Tab 1)。qPCR扩增条件为：95℃预变性3 min；95℃变性12 s，62℃延伸40 s，40个循环。用ΔΔCT来计算基因的表达水平，计算公式如下：ΔCT=目的基因CT值-β-actin基因CT值；ΔΔCT=实验组ΔCT-对照组ΔCT；实验组/对照组基因表达水平的倍数=2-ΔΔCT。
| Gene | Primer sequence | Size/bp |
| β-actin | F：5′-CCCTGGCACCCAGCAC-3′ | 70 |
| R：5′-GCCGATCCACACGGAGTAC-3′ | ||
| LDLR | F：5′-GACTGGTCAGATGAACCCATCAAAG-3′ | 79 |
| R：5′-AGGTCATTGCAGACGTGGGAAC-3′ | ||
| SREBP-2 | F：5′-CAGCAGCCTTTGATATACCAGAATG-3′ | 86 |
| R：5′-AGGATGTCACCAGGCTTTGGAC-3′ | ||
| PCSK9 | F：5′-CCAGTTTCTCCAGGAGTGGGAAG-3′ | 112 |
| R：5′-GCAATGGCGTAGACACCCTCAC-3′ |
对数期生长HepG2细胞以1×106个细胞/孔接种至50 mL培养瓶，培养24 h，药物孵育24 h。收集细胞裂解液，离心，取上清，取5 μL蛋白液进行BCA蛋白定量。剩余蛋白液加入SDS-loading buffer，100℃条件下煮沸10 min，于-20℃保存，用于Western blot实验。Tanon ECL高敏成像系统对结果进行检测。各组细胞目的蛋白与内参β-actin的光密度比值，分别代表各目的蛋白表达水平。
1.9 统计学分析数据均采用SPSS 20、Image J及GraphPad Prism 5.0等软件进行统计学分析和图标绘制，数值以x±s表示，两组间的比较用t检验及方差分析。
2 结果 2.1 油红O染色观察烟酸对HepG2细胞内脂质蓄积的影响油红O染色观察，HepG2细胞中脂滴颗粒被染成橘红色，核呈蓝色。结果显示：与Basal组相比，Control组细胞内脂滴增多，提示本实验荷脂成功；与Control相比，Vehicle组细胞内红染脂滴无明显变化，提示溶媒对实验无影响。Niacin组油红O阳性细胞数及细胞内红染脂滴明显增加，见Fig 1。
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| Fig 1 Oil red O staining of HepG2 cells treatedwith niacin co-incubated with LDL (×40) A:Niacin; B:Basal; C:Control; D:Vehicle |
为了进一步定量分析细胞内胆固醇含量，酶法测定结果显示：与Basal组相比，Control细胞内TC、FC水平增高，提示本研究细胞荷脂造模成功；与Control相比，Vehicle组细胞内TC水平有增高的趋势，FC水平有所下降，但差异无统计学意义(P > 0.05)，提示溶媒对细胞摄取胆固醇无影响；Niacin组细胞内TC、FC水平明显增高(P < 0.01)。提示烟酸促使HepG2细胞摄取胆固醇，见Fig 2。
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| Fig 2 Effect of niacin on totalcholesterol and free cholesterol in HepG2 cells **P < 0.01 vs control |
本研究推测细胞内胆固醇含量增加可能是烟酸通过上调LDLR的表达，进而促进HepG2细胞对LDL-C的摄取。接下来运用流式细胞术、qPCR及Western blot检测LDLR的表达。结果显示，与对照组相比，烟酸处理的HepG2细胞中，LDLR mRNA含量升高，但差异无统计学意义(P > 0.05)；细胞膜表面LDLR分布丰度及细胞内LDLR蛋白含量却明显增加(P < 0.05)，见Fig 3。
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| Fig 3 Effect of niacin on expression of LDLR in HepG2 cells A:Cell surface LDLR was determined by FACS analysis. The relative expression of LDLR mRNA (B) and protein (C).*P < 0.05 vs control |
LDLR的表达主要在转录水平受到SREBP2的调节，为了探究烟酸是否影响SREBP2，进而调控LDLR的表达，本研究检测了烟酸对SREBP2表达的影响。结果显示，烟酸处理组细胞内SREBP2的mRNA和蛋白表达都无明显改变。提示烟酸升高LDLR含量并不是通过SREBP2的转录水平调节，见Fig 4。
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| Fig 4 Effect of niacin on expression of SREBP2 in HepG2 cells The relative expression of SREBP2 mRNA (A) and protein (B). SREBP2 precursor (p) and mature form (m).*P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
PCSK9是LDLR转录后水平的主要调控者。在生理条件下，PCSK9前体(PCSK9 precursor, pPCSK9) 经过加工剪切形成成熟体(mature PCSK9, mPCSK9)，而mPCSK9则可以在翻译后水平调节LDLR的表达。为了探究在烟酸的作用下，LDLR是否受到PCSK9的转录后调节，本研究检测了烟酸对PCSK9表达的影响，并检测了mPCSK9的相对含量。结果显示，烟酸明显减少了PCSK9的mRNA和成熟体蛋白含量(P < 0.05)。提示烟酸可能通过下调PCSK9的表达，减少PCSK9成熟体蛋白含量，使得LDLR降解减少，进而增加LDLR含量，促进HepG2细胞摄取LDL-C。见Fig 5。
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| Fig 5 Effect of niacin on expression of PCSK9 in HepG2 cells The relative expression of PCSK9 mRNA (A) and protein (B). PCSK9 precursor (p) and mature form (m).*P < 0.05 vs control |
在世界各地，心血管疾病的发病率逐渐升高，严重威胁着人类的健康。据世界卫生组织预测，到2020年，心血管疾病死亡率将占据我国非传染性死亡率的首位[13]。LDL-C升高是心血管疾病发生的独立危险因素[14]，因此，有效地降低血浆LDL-C对预防和治疗心血管疾病至关重要。
烟酸作为目前临床上常用的一种降脂药物[15-16]，在药理剂量下，单独使用烟酸可以增加血浆HDL-C水平，并且明显降低血浆中LDL-C、VLDL及LDL水平[17-18]；烟酸联合其他降脂药物(如他汀类、贝特类、胆酸螯合剂类药物)，可以使HDL-C水平升高，LDL及TG水平明显下降[19]。烟酸升高血浆HDL的作用已被认可，但降低LDL-C的作用却有待完善。
为找寻烟酸降低血浆LDL-C的分子靶点，本实验以HepG2细胞为研究对象，LDL孵育细胞，模拟高脂环境，烟酸药物处理。油红O染色观察细胞内脂滴蓄积，并用酶法定量检测胆固醇含量，充分考虑溶媒对细胞的影响。在溶媒对实验无影响的前提下，合理地设计了LPDS的阳性对照[20]及25-羟胆固醇(25-HC) 的阴性对照[21]。
本研究发现，在模拟的高脂环境下，烟酸能上调HepG2细胞LDLR蛋白的表达，进而促进细胞摄取及代谢LDL。检测LDLR表达的主要调节因子发现，SREBP2的表达并没有受到影响，这也意味着，烟酸并没有在转录水平上影响LDLR的表达。qPCR结果亦证实烟酸处理组LDLR的mRNA表达水平无明显升高。检测LDLR转录后调节因子的表达发现，烟酸处理组细胞中的PCSK9成熟体蛋白含量明显减少。提示烟酸可能通过下调PCSK9的表达，阻碍PCSK9蛋白成熟过程，进而减少PCSK9的成熟体蛋白含量，使得LDLR降解减少。这一点与前面的结果相一致：烟酸影响LDLR的蛋白水平，却对其mRNA含量无影响。本研究只是做了初步探讨，要进一步确定PCSK9是烟酸降低LDL-C的分子靶点，还有大量的研究工作要做。
( 致谢: 感谢给予本文实验提供研究场所的生物技术系的分子生物学实验室、蛋白化学实验室、细胞培养室、技能实验室及生物信息室的所有老师及同学，感谢本校省部级重点心血管病研究所、肿瘤研究所、病原微生物研究所对本实验无偿提供流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等服务。 )
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