2. 重庆市生物化学与分子药理学重点实验室, 重庆 400016
2. Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
结肠癌是消化系统的恶性肿瘤之一[1], 目前治疗所面临的主要困难在于常用化疗药物的不良反应严重和肿瘤细胞的转移。虽然近年来对结肠癌诊断和治疗技术有了一定的进展, 但预后仍不理想。因此, 临床仍需研发高效而低毒的药物用于治疗结肠癌。
熊果酸(ursolic acid, UA) 是从传统中草药中提取出的一种五环三萜类化合物, 具有多种药理活性, 如镇静、抗炎、抗菌、降糖和抗溃疡等[2]。近年来, UA因具有明显的抗肿瘤活性而备受关注[3]。文献报道, UA的抗肿瘤作用可能与抑制STAT3/COX-2、NF-κB、Wnt/β-catenin信号[4-7], 激活p53有关[8], 但具体分子机制目前仍然不清楚。
转化生长因子β(TGF-β) 对细胞的增殖与分化、胚胎发育以及血管生成等多种生理过程有重要的调控作用。TGF-β有3种亚型, 即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3, 三者均在结肠癌细胞中表达。研究表明, TGF-β3在肿瘤组织中呈明显异常高表达[9]。TGF-β信号与Wnt/β-catenin信号之间存在cross-talk[10], Wnt/β-catenin信号的异常是引发结肠癌的重要因素之一[11]。UA可以有效抑制结肠癌细胞增殖, 但这一作用是否与TGF-β3或Wnt/β-catenin信号有关, 尚不清楚。
本实验对UA抑制人结肠癌细胞增殖的作用进行了相关研究, 并分析介导UA这种作用的可能分子生物学机制。结果显示, UA明显抑制结肠癌细胞增殖, 并促进凋亡, 这种作用可能与UA通过下调TGF-β3表达, 进而抑制Wnt/β-catenin信号转导有关。
1 材料与方法 1.1 试剂与细胞培养熊果酸购自西安昊轩生物科技有限公司。HCT116细胞购自ATCC。本实验所用TGF-β3、Smad2/3、p-Smad2/3、Bcl-2、Bad和GAPDH等一抗均购自Santa Cruz Biotechnology公司。TGF-β3特异性抑制剂(2-methoxyestradiol) 购自赛力克公司。细胞培养采用DMEM高糖培养基(含10%的胎牛血清、100 kU·L-1青霉素以及0.1 g·L-1链霉素), 细胞培养条件为5%的CO2和37 ℃。
1.2 重组腺病毒载体构建本实验使用的重组腺病毒载体通过AdEasy系统构建[12]。方法简述如下: 以EST克隆为模板, 用高保真Taq酶通过PCR将目的基因编码序列扩增并克隆到穿梭质粒中。线性化穿梭质粒后与骨架质粒进行同源重组, 将重组正确的质粒线性化后转染到HEK-293细胞中进行病毒包装, 得到目的基因的重组腺病毒载体(以绿色荧光蛋白进行标记)。所建病毒载体包括绿色荧光蛋白重组腺病毒载体(AdGFP, 作为对照) 和TGF-β3重组腺病毒载体(Ad TGF-β3)。
1.3 细胞增殖检测实验将生长状态良好的HCT116细胞均匀种到24孔板中, 按实验设计加入相应浓度的UA处理细胞(对照组细胞用相同体积的DMSO处理)。于相应时间点进行结晶紫染色[11], 检测UA对HCT116细胞增殖的影响情况。弃培养基, 用PBS小心清洗孔板。每孔加入500 μL结晶紫饱和溶液(用PBS缓冲的10%甲醛配制), 室温下孵育20 min, 然后弃染液并用自来水小心清洗孔板。将孔板在室温下晾干并扫描, 再用20%的乙酸溶解结晶紫, 于590 nm测定吸光度。每组实验重复3次。
1.4 细胞周期及凋亡检测实验将HCT116细胞均匀种于6孔细胞培养板中。贴壁后, 按实验设计加入相应浓度的UA进行处理。48 h后收集细胞, 并用PBS (4 ℃) 清洗, 按试剂盒的说明进行操作。最后通过流式细胞仪进行细胞周期分析。采用Annexin V-EGFP和PI双染法处理细胞, 然后通过流式细胞仪分析。每组实验重复3次。
1.5 RNA提取及RT-PCR实验将细胞种到T25培养瓶中, 并用相应浓度的UA进行处理。采用TRIzol法提取总RNA, 经逆转录反应制备成cDNA。最后, 通过PCR检测目的基因mRNA的表达水平。本实验所用引物序列如下: GAPDH上游引物5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3′, 下游引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′; TGF-β3上游引物5′-TGGTTAGAGGAAGGCTGAACTC-3′, 下游引物5′-ATGAGCAAATCCAACCTCAGAT-3′。每组实验重复3次。
1.6 Western blot实验将生长良好的细胞均匀种于6孔细胞培养板中, 待细胞贴壁后, 按实验设计加入相应浓度的UA进行处理。于处理后相应的时间点提取各组总蛋白, 通过BCA法测定总蛋白浓度。SDS-PAGE法进行Western blot操作, 利用ECL化学发光法显影并采集图像。每组实验重复3次。
1.7 萤光素酶报告质粒检测将生长状态良好的HCT116细胞种于T25培养瓶中, 贴壁后Lipofectamine 2000转染LEF/TCF4报告质粒(pTOP-Luc)3μg, 4 h后换液。24 h后将细胞收集, 并重新种于24孔细胞培养板中, 分别用不同浓度的UA处理。24 h后, 弃培养基并裂解细胞, 按试剂盒操作说明测定萤光素酶活性。用BCA法测定裂解液总蛋白浓度, 用于标准化萤光素酶活性。每组实验重复3次。
1.8 统计学分析所有实验数据以x±s表示, 采用t-test进行组间比较。
2 结果 2.1 UA对HCT116细胞增殖的影响结晶紫染色结果显示, UA能有效地抑制HCT116细胞增殖, 且抑制作用呈浓度和时间依赖性增强(Fig 1A); 定量分析结果显示, UA在15 μmol·L-1时已能明显抑制细胞增殖(Fig 1B)。流式细胞术分析结果显示, 与对照组相比, UA能明显诱导HCT116细胞发生G1期阻(Fig 1C)。结果提示, UA对HCT116细胞的增殖具有明显抑制作用。
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| Fig 1 Effects of UA on proliferation in HCT116 cells A:The crystal violet staining showed the effect of UA on proliferation in HCT116 cells; B:The quantification results of crystal violet staining showed the effect of UA on proliferation in HCT116 cells.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control; C:Flow cytometry analysis results showed the effect of UA on cell cycle in HCT116 cells |
本研究进一步分析UA能否诱导结肠癌细胞凋亡。Western blot分析结果显示, UA明显增加Bad的水平, 同时降低Bcl-2的水平(Fig 2A)。流式细胞术分析结果显示, UA明显呈浓度依赖性增加HCT116细胞凋亡比例(Fig 2B)。以上结果提示, UA对HCT116细胞凋亡具有促进作用。
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| Fig 2 Effects of UA on apoptosis in HCT116 cells A:Western blot results showed the effect of UA on the level of Bad and Bcl-2 in HCT116 cells; B:Flow cytometry analysis results showed the effect of UA on cell cycle in HCT116 cells |
TGF-β信号对细胞的增殖与分化有重要调节作用, 该信号异常与结肠癌的发生和进展密切相关。因此, 我们接着分析UA对HCT116细胞的抗增殖作用是否与TGF-β有关。PCR和Western blot实验结果显示, UA呈浓度和时间依赖性降低TGF-β3的mRNA和蛋白水平; 同时, UA也明显降低Smad2/3的磷酸化水平, 但对Smad2/3的总蛋白表达没有明显影响(Fig 3)。结果提示, UA对HCT116细胞的抗增殖作用可能与抑制TGF-β3有关。
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| Fig 3 Effect of UA on TGF-β3 and Samd2/3 in HCT116 cells A:PCR analysis results showed the effect of UA on the level of TGF-β3 in HCT116 cells; B:Western blot analysis results showed the effect of UA on the levels of TGF-β3, Smad2/3 and phosphorylation of Smad2/3 in HCT116 cells |
为明确UA对HCT116细胞的抗增殖作用是否与其下调TGF-β3有关, 本研究利用重组腺病毒介导的TGF-β3过表达或TGF-β3特异性抑制剂进行相关实验。细胞周期分析结果显示, 外源性过表达TGF-β3部分逆转UA诱导的G1期阻滞, 但TGF-β3抑制剂则增强UA诱导G1期阻滞的作用(Fig 4A)。结晶紫染色结果显示, 外源性过表达TGF-β3能部分逆转UA的抗增殖作用(Fig 4B), TGF-β3特异性抑制剂则增强UA对HCT116细胞的增殖抑制作用(Fig 4C)。结果提示, 下调TGF-β3表达能部分介导UA对HCT116细胞的增殖抑制作用, 但具体机制尚不清楚。
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| Fig 4 Effect of TGF-β3 on anti-proliferation effect of UA in HCT116 cells A:Flow cytometry analysis results showed the effect of TGF-β3 on the cell cycle arrest effect of UA in HCT116 cells; B:The crystal violet staining results showed the effect of TGF-β3 on the anti-proliferation effect of UA in HCT116 cells; C:The crystal violet staining results showed the effect of TGF-β3 specific inhibitor on the anti-proliferation effect of UA in HCT116 cells (2-MeOE2:TGF-β3 inhibitor) |
Wnt/β-catenin信号参与细胞增殖与分化的调节, 该信号异常也是结肠癌发生的主要原因之一。因此, 我们进一步分析在HCT116细胞中UA是否会影响Wnt/β-catenin信号。萤光素酶报告质粒和Western blot结果显示, UA呈浓度依赖性抑制LEF/Tcf4报告质粒的转录活性(Fig 5A), 并明显降低HCT116细胞中β-catenin的蛋白水平(Fig 5B)。UA对GSK3β的总蛋白无明显影响, 但能降低GSK3β的磷酸化水平(Fig 5B)。这些结果提示, UA的抗增殖作用可能与抑制Wnt/β-catenin信号转导有关。我们推测, TGF-β3表达的下调可能与Wnt/β-catenin信号被抑制有关。实验结果显示, 在HCT116细胞中, TGF-β3特异性抑制剂降低β-catenin蛋白表达, 并增强UA对β-catenin表达的抑制作用(Fig 5C); 外源性过表达TGF-β3促进β-catenin蛋白表达, 并部分逆转UA对β-catenin表达的抑制作用(Fig 5D)。以上结果提示, 在人结肠癌细胞中, UA能通过下调TGF-β3实现对Wnt/β-catenin信号转导的抑制作用。
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| Fig 5 Effect of TGF-β3 on Wnt/β-catenin signaling in HCT116 cells A:Luciferase reporter assay results showed the effect of UA on Wnt/β-catenin in HCT116 cells; B:Western blot analysis results showed the effect of UA on GSK-3β and the phosphorylation of GSK-3β in HCT116 cells; C:Western blot analysis results showed the effect of TGF-β3 specific inhibitor on the UA-induced decrease of β-catenin in HCT116 cells (2-MeOE2:TGF-β3 inhibitor); D:Western blot analysis results showed the effect of TGF-β3 on the UA-induced decrease of β-catenin in HCT116 cells |
从传统中草药提取的天然产物或其衍生物是肿瘤化疗药物的重要来源之一, 如长春新碱、喜树碱和紫杉醇等早已用于临床。UA作为一种五环三萜类化合物, 普遍存在于多种药用植物与水果中, 且具有多种药理活性, 如镇静、降糖、抗炎和抗菌等。近年研究证实, UA还具有明显的抗肿瘤活性[3, 13]。其抗瘤机制可能与抑制STAT3、NF-κB、Wnt/β-catenin等有关[4, 14-15], 但具体机制仍不清楚。本研究证实, UA能明显抑制人结肠癌细胞HCT116增殖, 机制分析表明, UA的这种作用可能与通过下调TGF-β3表达, 进而抑制Wnt/β-catenin信号转导有关。
TGF-β是一类分泌型蛋白, 通过激活经典Smads途径, 参与调节细胞的增殖、分化或凋亡等生理过程。TGF-β首先与其Ⅱ型受体结合, 募集并使Ⅰ型受体磷酸化, 活化后的Ⅰ型受体再募集并磷酸化Smad2与Smad3。磷酸化的Smad2/3使Smad4磷酸化, 并与之结合形成异二聚体, 然后转位入核, 与相应的效应元件结合, 调节下游靶基因表达。研究报道, TGF-β信号通路的异常是结肠癌的主要病因之一, 其3种亚型均与结肠癌相关[16]。由于TGF-β3在肿瘤组织中的表达水平明显要高于正常肠黏膜组织[9], 因此我们推测TGF-β3在结肠癌的发展中可能起着关键作用。我们的研究结果已经证实, UA对结肠癌细胞具有抗增殖作用, 但这种效应是否与TGF-β3有关仍不清楚。通过进一步分析, 结果显示UA明显抑制TGF-β3表达, 并明显降低Smad2/3的磷酸化水平; 外源性过表达TGF-β3则能部分逆转UA对HCT116细胞的增殖抑制作用, 而抑制TGF-β3则相应增强UA对HCT116细胞的抗增殖作用。以上结果提示, UA对HCT116细胞增殖的抑制作用可能与其下调TGF-β3表达有关, 但TGF-β3介导UA这种作用的机制尚不清楚。
Wnt/β-catenin信号的异常是结肠癌的重要发病原因之一。这种异常可能与其重要成员突变有关, 如APC和β-catenin等[11]。除此之外, Wnt/β-catenin信号本身也受其他信号的调节, 如IGFs、PI3K/Akt、p53、TGF-β等。其中, TGF-β3受到Wnt/β-catenin信号的调节[17], 即TGF-β3与Wnt/β-catenin信号之间可能存在相互调节的关系, 但在结肠癌细胞中, TGF-β3与Wnt/β-catenin信号之间的关系仍不清楚。我们的实验结果显示, 在HCT116细胞中, UA明显抑制Wnt/β-catenin信号转导, 并明显降低β-catenin的蛋白表达水平; 外源性过表达TGF-β3部分逆转UA对β-catenin表达的抑制作用; 抑制TGF-β3则能促进UA对β-catenin表达的抑制作用。
本研究表明, UA对人结肠癌HCT116细胞具有增殖抑制作用, 这种作用可能与其通过下调TGF-β3表达水平, 进而抑制Wnt/β-catenin信号转导有关。但在结肠癌细胞中, UA抑制TGF-β3表达, 以及TGF-β3调节Wnt/β-catenin信号转导的具体过程还有待进一步深入研究。
( 致谢: 本实验在重庆市生物化学与分子药理学重点实验室完成。感谢何通川教授(Tong-Chuan He, 芝加哥大学医学中心) 为本研究提供重组腺病毒。 )
| [1] | Roy S, Majumdar A P. Signaling in colon cancer stem cells[J]. J Mol Signal, 2012, 7 (1): 11. |
| [2] | Zang L L, Wu B N, Lin Y, et al. Research progress of ursolic acid′s anti-tumor actions[J]. Chin J Integr Med, 2014, 20 (1): 72-9. doi:10.1007/s11655-013-1541-4 |
| [3] | Chen H, Gao Y, Wang A, et al. Evolution in medicinal chemistry of ursolic acid derivatives as anticancer agents[J]. Eur J Med Chem, 2015, 92 : 648-55. doi:10.1016/j.ejmech.2015.01.031 |
| [4] | 唐丹, 李剑萍, 郑锡凤, 等. 熊果酸通过STAT3通路调控胃癌细胞增殖和凋亡[J]. 中国药理学通报, 2012, 28 (2): 179-84. Tang D, Li J P, Zheng X F, et al. Ursolic acid regulates the proliferation and aoptosis in gastric cancer through STAT3 pathway[J]. Chin Pharmacol Bull, 2012, 28 (2): 179-84. |
| [5] | 朱悦, 周逸婵, 朱国琴, 等. 熊果酸抑制胃癌细胞COX-2表达的信号转导研究[J]. 中国药理学通报, 2016, 32 (7): 925-32. Zhu Y, Zhou Y C, Zhu G Q, et al. Signal transduction pathway of ursolic acid inhibiting COX-2 expression in gastric cancer cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2016, 32 (7): 925-32. |
| [6] | Park J H, Kwon H Y, Sohn E J, et al. Inhibition of Wnt/beta-catenin signaling mediates ursolic acid-induced apoptosis in PC-3 prostate cancer cells[J]. Pharmacol Rep, 2013, 65 (5): 1366-74. doi:10.1016/S1734-1140(13)71495-6 |
| [7] | Yie Y, Zhao S, Tang Q, et al. Ursolic acid inhibited growth of hepatocellular carcinoma HepG2 cells through AMPKalpha-mediated reduction of DNA methyltransferase 1[J]. Mol Cell Biochem, 2015, 402 (1-2): 63-74. doi:10.1007/s11010-014-2314-x |
| [8] | Prasad S, Yadav V R, Sung B, et al. Ursolic acid inhibits growth and metastasis of human colorectal cancer in an orthotopic nude mouse model by targeting multiple cell signaling pathways: chemosensitization with capecitabine[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18 (18): 4942-53. doi:10.1158/1078-0432.CCR-11-2805 |
| [9] | Laverty H G, Wakefield L M, Occleston N L, et al. TGF-beta3 and cancer: a review[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2009, 20 (4): 305-17. doi:10.1016/j.cytogfr.2009.07.002 |
| [10] | Guerrero F, Herencia C, Almaden Y, et al. TGF-beta prevents phosphate-induced osteogenesis through inhibition of BMP and Wnt/beta-catenin pathways[J]. PLoS One, 2014, 9 (2): e89179. doi:10.1371/journal.pone.0089179 |
| [11] | 刘映孜, 金洁利, 黄军, 等. 粉防己甲素抑制人结肠癌细胞增殖与Wnt/β-catenin信号的关系研究[J]. 中国药理学通报, 2014, 29 (1): 30-4. Liu Y Z, Jin J L, Huang J, et al. Study on the relationship between the anti-proliferation effect of tetrandrine and Wnt/β-catenin signal in colon cancer cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2014, 29 (1): 30-4. |
| [12] | Luo J, Deng Z L, Luo X, et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system[J]. Nat Protoc, 2007, 2 (5): 1236-47. doi:10.1038/nprot.2007.135 |
| [13] | Kashyap D, Tuli H S, Sharma A K. Ursolic acid (UA): a metabolite with promising therapeutic potential[J]. Life Sci, 2016, 146 : 201-13. doi:10.1016/j.lfs.2016.01.017 |
| [14] | Kim J H, Kim Y H, Song G Y, et al. Ursolic acid and its natural derivative corosolic acid suppress the proliferation of APC-mutated colon cancer cells through promotion of β-catenin degradation[J]. Food Chem Toxicol, 2014, 67 : 87-95. doi:10.1016/j.fct.2014.02.019 |
| [15] | Lin J, Chen Y, Wei L, et al. Ursolic acid inhibits colorectal cancer angiogenesis through suppression of multiple signaling pathways[J]. Int J Oncol, 2013, 43 (5): 1666-74. |
| [16] | Lampropoulos P, Zizi-Sermpetzoglou A, Rizos S, et al. TGF-beta signalling in colon carcinogenesis[J]. Cancer Lett, 2012, 314 (1): 1-7. doi:10.1016/j.canlet.2011.09.041 |
| [17] | He F, Xiong W, Wang Y, et al. Epithelial Wnt/β-catenin signaling regulates palatal shelf fusion through regulation of TGFβ3 expression[J]. Dev Biol, 2011, 350 (2): 511-9. doi:10.1016/j.ydbio.2010.12.021 |