2. 浙江大学明州医院，浙江 温州 315000;
3. 温州医科大学， 浙江 温州 325000
2. Zhejiang University Mingzhou Hospital, Ningbo Zhejiang 315000, China ;
3. Wenzhou Medical University, Wenzhou Zhejiang 325000, China
酒精成瘾，又称为酒精依赖症，是一类被人们忽视的中枢神经性疾病。据调查，我国约有4.7%的成年居民存在过量饮酒的状况[1]。长期过量饮酒可造成酒精成瘾，将对躯体造成严重损伤，尤其是酒精对中枢神经系统的损害极为严重，临床上称其为酒精中毒性精神障碍，其中以记忆功能障碍最为明显。大量研究发现过量酒精会损伤记忆相关的重要脑区，如海马、前额叶皮层等，导致慢性神经炎症的发生，神经营养物质减少及神经毒性物质释放，进而导致神经细胞大量凋亡[2-5]。
虾青素(astaxanthin,ASX)是一种类胡萝卜素，是世界上最强的天然抗氧化剂之一，其主要成分反式虾青素的抗氧化活性超过现有的所有抗氧化剂[6]。反式虾青素清除自由基的能力显著，其功效是维生素C的6 000倍；是维生素E的1 000倍。此外，反式虾青素还有一个优点，即其是唯一能通过血脑屏障的一种类胡萝卜素。大量的研究也证实虾青素的抗炎抗氧化作用与重要神经炎症调节机制—NF-κB信号通路密切相关[7-8]，并且其对中枢神经系统病变疾病，如阿尔兹海默病[9]、帕金森病[10]等均有一定的治疗效果。
本项目基于反式虾青素的强抗炎抗氧化作用，以及酒精成瘾与慢性神经炎症、过氧化神经毒性物质存在相关性，以NF-κB为突破口，进一步检测脑内不同脑区NF-κB调控的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮合酶(iNOS)的表达，深入探讨反式虾青素是否通过抑制NF-κB，进而影响TNF-α与iNOS的表达，从而改善酒精诱导的记忆功能障碍。本研究采用慢性酒精成瘾小鼠模型，并在经典模型基础上稍作修改，模拟临床酒精戒断后复饮的现象，观察小鼠在反复戒断及复饮后，反式虾青素对记忆相关行为的影响及相关蛋白表达的改变。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物成年♂ ICR小鼠80只，6～8周龄，购于温州医科大学实验动物中心(实验动物许可证号：SYXK(浙)2015-0009)。动物自由进食及饮水。本实验涉及的动物实验符合1986 年11 月欧洲共同体理事会指导，并通过复旦大学动物护理和使用委员会批准。所有动物行为学相关的实验均在上午8点～10点进行。
1.1.2 实验试剂与设备无水乙醇购于无锡佳妮化工有限公司(分析纯，批号：20150420)，反式虾青素(批号：41659)购于Sigma公司； NF-κB p65 抗体(批号：MAB7264)购于R&D公司；iNOS抗体(批号：ab3523，稀释倍数1 ∶1 000)、TNF-α抗体(批号：ab6671，稀释倍数1 ∶1 000)、β-actin抗体(货号：ab1801，稀释倍数1 ∶1 000)、ECL曝光液(批号：120711-92) 购于英国Abcam 公司；兔Ⅱ抗(批号sc-2004，400 mg·L-1，稀释倍数1 ∶1 000)及鼠Ⅱ抗(批号：sc-2005,400 mg·L-1,稀释倍数1 ∶1 000)均为多克隆抗体，均购于Santa Cruz公司；脱脂奶粉(批号：3106120)购于碧迪医疗器械(上海)有限公司；Tris-Hcl(批号：B0012K02130001)购于中国Biosharp公司；APS(货号：ST005)、SDS(货号：ST627)、TEMED(货号：ST728)及BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：P0012)均购于上海碧云天生物技术有限公司；聚丙烯酰胺(批号：20130423)和PVDF膜(货号：IPVH00011)购于Solarbio公司。
BS 110S 型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)；JY92 2D 超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；WH 966 漩涡混合器(太仓市科教器材厂)；64 R 超速冷冻离心机(Beckman Coulter公司)；BIO-RAD电泳与转膜设备(美国BIO-RAD公司)；自动酶标分析仪(美国Bio-Rad公司)。
1.2 方法 1.2.1 实验设计实验分为两部分。第一部分：首先通过酒精偏好测试观察动物模型情况，进一步评价新型酒精成瘾模型小鼠不同时间点的记忆行为，确定小鼠记忆功能障碍形成的时间。小鼠随机分5组，即正常对照组、慢性酒精成瘾(7 d组、14 d组、21 d组和28 d组)，每组8只小鼠，共40只。第二部分：以第一部分结果为基础，确定记忆损伤模型的成模时间，进而评价反式虾青素在慢性给药后对小鼠记忆行为的影响，并进一步检测相关蛋白的表达。小鼠随机分为5组，即正常对照组、酒精成瘾模型组、酒精+反式虾青素(20、40、80 mg·kg-1; p.o.)组，每组8只小鼠，共40只。反式虾青素均采用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解，且每日新鲜配制，其他各组则给予CMC-Na，反式虾青素的给药剂量依据相关文献[11]。各组动物均在行为学检测后处死，断头取脑，迅速分离海马和前额叶皮层以进行后续的生化指标的测定。
1.2.2 慢性酒精成瘾小鼠模型[12]小鼠分为慢性酒精成瘾7 d组、14 d组、21 d组、28 d和正常对照组。3~5只小鼠饲养为一笼。以1 mol·L-1酒精为初始浓度，按10 mL·kg-1量取酒精溶液。第2、3、4周酒精浓度分别为2、4和7 mol·L-1。除正常对照组以外，所有小鼠均给予酒精，小鼠在d 6、d 13、d 20与d 27进行酒精偏好测试。测试后，停止给予酒精，戒断1 d后继续给予酒精，模拟戒断和复饮过程，正常对照组则在全过程中给予正常饮水。
1.2.3 酒精偏好测试仿照糖水消耗实验方法[13]，对小鼠进行酒精消耗测试。在小鼠进行行为学测试前，禁水24 h，单独给予每只小鼠酒精与水，记录1 h内酒精与水的摄入量，用酒精摄入比率表示对酒精的偏好程度。酒精摄入率/%=酒精摄入量/(酒精摄入量＋水摄入量)×100%。
1.2.4 Morris水迷宫测试方法参照文献[14]，圆形水池直径95 cm，平台位于水下2 cm，水温恒定在24 ℃。圆形水池被分为4个象限，在第三象限中央放置平台。水迷宫实验分为2部分：训练与测试部分。训练部分，共有6次寻找平台的独立训练，同一只小鼠每次在不同象限内的不同位置下水，寻找平台的时间为60 s，若在60 s内没有找到平台，则将小鼠引导至平台上，停留10 s。测试部分，训练结束后1 h进行短时记忆测试，训练后24 h进行长时记忆测试。测试时移除第三象限的平台，小鼠在第二象限入水，游泳时间60 s，观察小鼠到达原第三象限平台放置位置的潜伏期，原平台放置位置出现的频次和第三象限停留的累计时间。
1.2.5 蛋白免疫印迹法所有行为学测试结束后，迅速脱颈处死小鼠，并剥离大脑，在4℃下分离海马和前额叶皮层脑区，组织称重后冻存。用RIPA 裂解液裂解组织，并用 BCA 法进行蛋白定量，确定上样量。电泳及转膜后，在室温下用封闭液封闭1 h，随后TBST洗膜，再加入一抗(NF-κB p65、iNOS或TNF-α)4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入与一抗对应的二抗，孵育1 h。用TBST 洗膜后，曝光显影。所有蛋白的表达均以β-actin作为参照，以两者吸光度的比值百分率表示蛋白的相对表达量。
1.2.6 统计学分析采用SPSS16.0统计进行统计学分析，数据以x±s表示，数据进行单因素方差分析，组间的多重比较采用Dunnett’s t进行检验分析。
2 结果 2.1 动物行为学测试结果 2.1.1 慢性酒精成瘾过程中对酒精的依赖程度Fig 1所示，7 d组小鼠在酒精偏好测试中，与正常对照组相比，对酒精的偏好程度有增加的趋势，但数据差异无统计学意义，而14 d组、21 d组和28 d组，对酒精的偏好程度明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。
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| Fig 1 Effects of chronic alcohol consumption on alcohol preference test in 7 d,14 d,21 d and 28 d group mice(x±s,n=8) **P＜0.01 vs control group |
水迷宫训练后1 h测试，观察小鼠短时记忆的变化(Fig 2)，结果显示与正常组相比，饮酒14 d小鼠找到目标平台的潜伏期明显增加(P＜0.05)，并且这一现象随着戒断次数和饮酒天数的增加变得更为明显，21 d组与28 d组均明显增加(P＜0.01,P＜0.01)；相对的，训练后24 h的长时记忆也有相似的变化(Fig 3)，表明小鼠饮酒14 d后，开始出现记忆功能障碍，随着时间的推移，这一现象更为明显。同时我们也观察了小鼠进入目标平台象限的次数及在平台象限停留的时间，与正常对照组相比，无论是短时记忆还是长时记忆测试中，21 d和28 d组小鼠进入次数及停留时间均明显减少。此外，我们也测定了小鼠在测试过程中的游泳速度，结果显示各组小鼠游速并无差异，表明酒精并不影响小鼠正常机体活动。
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| Fig 2 Latency to reach platform (A),entries (B) and duration (C) in the target quadrant,and swimming speed (D) during 1 h probe trials of water maze after 7 d,14 d,21 d and 28 d alcohol consumption(x±s,n=8) *P＜0.05,**P＜0.01 vs control group. |
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| Fig 3 Latency to reach platform (A),entries (B) and duration (C) in target quadrant,and swimming speed (D)during 24 h probe trials of water maze after 7 d,14 d,21 d and 28 d alcohol consumption(x±s,n=8) *P＜0.05,**P＜0.01 vs control group. |
以2.1.2的结果为基础，确定小鼠在饮酒戒断21 d后出现明显的记忆功能障碍。如Fig 4和5所示，与正常组相比，慢性21 d饮酒的小鼠出现明显短期和长期的记忆功能障碍，表现为找到平台潜伏期增加(P＜0.01)、进入目标象限次数和停留时间减少(P＜0.01)，而与模型组相比，21 d慢性给予反式虾青素(80 mg·kg-1)能明显改善酒精对长期记忆的损伤，减少找到平台的潜伏期(P＜0.01)，同时增加进入目标象限次数和停留时间(P＜0.01)，并且各组小鼠的游泳速度并无差异，表明反式虾青素不会影响小鼠的正常活动。
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| Fig 4 Latency to reach platform (A),entries (B) and duration (C) in target quadrant,and swimming speed (D) during 1 h probe trials of water maze after chronic treatment with ASX in alcohol model mice(x±s,n=8) **P＜0.01 vs control group; #P＜0.01,##P＜0.01 vs Alcohol-treated group. |
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| Fig 5 Latency to reach platform (A),entries (B) and duration (C) in target quadrant,and swimming speed (D) during 24 h probe trials of water maze after chronic treatment with ASX in alcohol model mice(x±s,n=8) **P＜0.01 vs control group; #P＜0.01,##P＜0.01 vs alcohol-treated group. |
p65蛋白表达的影响 如Fig 6所示，慢性酒精成瘾组小鼠海马与前额叶皮层的NF-κB p65蛋白表达，与正常组相比，明显增加(P＜0.01)。与模型组相比，反式虾青素(80 mg·kg-1)能明显减少海马、前额叶皮层脑区的NF-κB p65蛋白表达(P＜0.01,P＜0.05)。
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| Fig 6 Effect of ASX on expression of NF-κB p65 in hippocampus (A1,A2) and frontal cortex (B1,B2) of mice Lane 1: control group; lane 2: alcohol-treated group; lane 3~5: 20,40,80 mg·kg-1 ASX pretreated group. A2 and B2 were the semi quantitative results of A1 and B1. Results are expressed as x±s from 6 mice. **P＜0.001 vs control group; # P＜0.01,##P＜0.01 vs alcohol-treated group. |
为研究NF-κB p65核转录相关蛋白是否与反式虾青素的促智作用有关，实验进一步检测了iNOS和TNF-α的蛋白表达。如Fig 7和8所示，21 d酒精损伤后，海马脑区的iNOS和TNF-α蛋白表达明显增加(P＜0.01)，前额叶皮层脑区iNOS和TNF-α蛋白表达也明显增加(P＜0.01)。与模型组相比，反式虾青素(40、80 mg·kg-1)能明显减少海马脑区的iNOS和TNF-α蛋白表达；相比于海马脑区，仅有高剂量反式虾青素能减少前额叶皮层iNOS和TNF-α蛋白表达(P＜0.05)。
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| Fig 7 Effect of ASX on expression of iNOS in hippocampus (A1,A2) and frontal cortex (B1,B2) of mice Lane 1: control group; lane 2: alcohol-treated group; lane 3~5: 20,40,80 mg·kg-1 ASX pretreated group. A2 and B2 were the semi quantitative results of A1 and B1. Results are expressed as x±s from 6 mice. **P＜0.01 vs control group; #P＜0.05,##P＜0.01 vs alcohol-treated group. |
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| Fig 8 Effect of ASX on expression of TNF-α in hippocampus (A1,A2) and frontal cortex (B1,B2) of mice Lane 1: control group; lane 2: alcohol-treated group; lane 3~5: 20,40,80 mg·kg-1 ASX pretreated group. A2 and B2 were the semi quantitative results of A1 and B1. Results are expressed as x±s from 6 mice. **P＜0.01 vs control group; #P＜0.05,##P＜0.01 vs alcohol-treated group. |
酒精是人类历史上使用时间最长的一种成瘾物。过量饮酒会导致中枢神经系统受损，相关动物实验表明慢性酒精中毒后，动物将出现抑郁、焦虑、记忆功能障碍等一系列中枢病变。临床研究也发现，酒精依赖及出现戒断的患者首先多表现为：兴奋、躁动并出现幻觉等现象，随着依赖程度的加深及戒断次数的增多，患者出现判断力下降，洞察力变弱，认知能力下降等症状。本次实验采用经过改良的动物模型，相比于经典酒精成瘾模型，能较好的模拟临床患者对酒精依赖程度加深及戒断次数增多的过程，并采用水迷宫行为测试评价过程中的小鼠记忆认知功能的改变。结果表明，小鼠在饮酒14 d后，开始出现记忆功能障碍，并且随着戒断次数增加和饮酒时间的增长，记忆功能障碍表现得越明显。结果显示，在饮酒后21 d与28 d，记忆功能损伤较为严重，这表明此动物模型造成记忆损伤至少需要14 d，因此在后续研究中，采用21 d饮酒小鼠模型。
本研究以21 d饮酒小鼠模型为基础，进一步评价了不同剂量反式虾青素对酒精诱导的记忆功能障碍的作用。水迷宫实验结果发现，经过21 d反式虾青素慢性给药后，能明显翻转酒精引起的记忆功能障碍。在其他中枢神经系统疾病引起的记忆功能障碍研究中也佐证了本实验的研究结果[15-16]，表明虾青素确实具有改善记忆功能的作用。
基于反式虾青素对认知行为的影响，并结合反式虾青素的强抗氧化、抗炎作用，易透过血脑屏障的特点及其对重要神经炎症调节机制—NF-κB信号通路的调控作用，推测反式虾青素对记忆功能损伤的改善作用可能与NF-κB有关。同时相关研究指出酒精成瘾对中枢神经系统的损伤，以海马与前额叶皮层脑区受损最为明显，尸检结果发现海马存在明显的神经元丢失[17]。相关研究也发现海马胚胎细胞暴露于酒精中会引起酒精导致的细胞活力明显降低[18]。前额叶皮层与海马正是调节复杂认知功能的两大重要脑区，如短时记忆、长时记忆等的调节均与此两脑区息息相关。因此本实验检测了海马与前额皮层的NF-κB p65蛋白表达，结果发现酒精损伤后两脑区的蛋白表达明显增加，而慢性反式虾青素给药能明显翻转这一现象，表明反式虾青素对记忆损伤的改善作用可能与其抑制NF-κB通路有关。而且作为核转录因子的NF-κB调控着免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子，如TNF-α、IL-1β、iNOS、黏附分子、集落刺激因子等[19-20]。为进一步确认反式虾青素是否作用于NF-κB下游靶点，本研究还检测了TNF-α和iNOS的表达。
TNF-α作为一类重要的炎症因子，与记忆功能密切相关[21]，尤其是一些慢性疾病引起的记忆功能障碍，如阿尔兹海默病、抑郁症、原发性失眠等。最新研究发现[22]，酒精成瘾后脑内炎症明显增强，这一结果也在本实验的新型酒精成瘾模型中得到论证，相比于正常组，模型组海马与前额叶皮层脑区TNF-α表达明显增加。21 d慢性反式虾青素给药后，TNF-α表达明显降低，表明反式虾青素可以抑制 TNF-α的表达，从而改善记忆损伤。已有研究也证实反式虾青素可以通过抑制TNF-α的表达，继而改善中枢炎症引起的记忆功能障碍[23-24]。但是反式虾青素对TNF-α的抑制作用是否源于其对NF-κB的调控仍有待进一步论证。
iNOS是机体NOS活性氮自由基产生的催化酶，其含量与机体内炎症程度呈正相关。研究发现，在酒精成瘾过程中，iNOS表达明显增加，使得神经毒性增强，导致大量神经毒性物质分泌，造成中枢神经系统损伤，表现出记忆功能减弱，甚至出现记忆障碍[25]。本研究结果也发现，在新型动物模型中，21 d饮酒后iNOS表达明显增加，但这种iNOS表达增加现象可被反式虾青素所翻转，其中以海马脑区最为明显，这表明iNOS也是反式虾青素的潜在作用靶点之一，并且反式虾青素对海马神经细胞较为敏感。在其他中枢神经系统疾病研究中，也发现反式虾青素能够抑制iNOS表达[26-27]。本研究在酒精损伤模型中论证了这一观点，并发现反式虾青素对海马组织可能存在更强的亲和力，亦或是通过其他通路双重或多重抑制iNOS的表达。尽管反式虾青素对NF-κB确有抑制作用，但iNOS不仅仅是NF-κB通路下游细胞因子，因此反式虾青素对iNOS的抑制作用是否源于其对NF-κB的调控也仍需进一步验证。
综上所述，反式虾青素能明显改善酒精成瘾诱导的记忆功能障碍，这种改善作用可能与其对NF-κB表达的抑制作用，及其对TNF-α和iNOS表达的抑制作用密切相关。但这一分子机制仍需在更多的临床前及临床研究中论证。下一步研究将围绕反式虾青素对NF-κB通路的调控作用，探讨反式虾青素治疗记忆损伤的具体治疗靶点，同时也将研究反式虾青素是否通过其他信号转导通路调控炎症因子的表达，为反式虾青素应用于酒精成瘾的治疗奠定理论基础。
( 致谢: 本实验中动物行为学测试由温州医科大学药学重点实验室完成，脑组织生化检测由浙江医药高等专科学校药学实验室与明州医院检验科共同完成，感谢实验室与科室的老师对本实验的帮助与指导。 )
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