糖尿病是一种由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱疾病，与此同时还被广泛认为是一种慢性炎症性疾病。在长期高血糖的环境下会产生大量的ROS，大量的ROS产生可激活引起糖尿病肾病晚期糖基化终末产物(AGEs)途径[1]。由于糖尿病患者代谢紊乱影响了清除自由基的各种抗氧化酶的活性和表达，引起自由基增多，进而损伤肾脏组织[2]。所以降低或改善糖尿病患者的氧化应激状态，能有效缓解糖尿病患者病程进展，对其并发症的防治也起到很大的作用。
杨桃根(Averrhoacarambola L. root,ACLR)为酢浆草科属植物的新鲜或干燥根，其药理作用广泛，民间多用于改善消化功能、治疗咳嗽以及糖尿病 [3-4]。在我们的前期研究中已发现，杨桃根醇提物对糖尿病小鼠具有降血糖作用，杨桃根多糖有明显的体外抗氧化作用[5-6]。此外，杨桃根总提取物还可以降低糖尿病小鼠血清中游离脂肪酸(FFAs)水平，改善胰岛细胞凋亡[7]。故本研究将探讨杨桃根总提取物基于肾脏组织的氧化应激功能，对糖尿病小鼠血糖和肾脏损伤的影响。
1 材料与方法 1.1 实验动物与主要试剂SPF级♂ KM小鼠，体质量(20±2) g，由广西医科大学实验动物中心提供。动物饲养环境通风良好，室温18 ℃～25 ℃，相对湿度40%～70%，12 h光照昼夜循环。试验动物使用许可证SCXK(桂)2009-0002。缬沙坦片(北京京丰制药有限公司，批号：151019)；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ美国Sigma公司)；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20150927)；SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20150925)；丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所，批号20150925)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20150918)；ROS试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司，批号 20151017)；氧化氢酶(CAT)试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司，批号 20151009)；预染蛋白Marker(西安润德生物技术有限公司，批号QE15104)；Cyto-C、AIF、caspase-3蛋白抗体(武汉博士德有限公司，批号2691107)；HRP 标记的兔抗羊IgG抗体(Santa Cruz Biotechnology，批号CV20151028)；多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，批号SC-1507)。
1.2 仪器罗氏卓越型血糖仪(ACCU-CHEK Performa，注册证号：国食药监械(进)字2008第2403661号)；卓越金锐血糖试纸(注册证号：国食药监械(进)字2010第2400386号)；垂直电泳仪(BIO-RAD公司)；转膜及显影设备(BIO-RAD公司)；全自动生化分析仪(日立公司，7100)
1.3 糖尿病模型建立及分组给药取90只♂昆明小鼠，SPF级，体质量(20±2)g，造模前禁食12 h，随机选取10只作为正常对照组，其余小鼠分别尾静脉注射STZ(120 mg·kg-1)。72 h后尾巴取血测FBG，选取FBG 11.1 mmol·L-1以上的小鼠作为造模成功的糖尿病小鼠。将造模成功的小鼠随机分配成5个组，每组10只，分别为模型对照组，缬沙坦对照组(20 mg·kg-1)，EACR低、中、高剂量组(300、600、1 200 mg·kg-1)。成模后缬沙坦组对照组、EACR各给药组每天上午空腹灌胃给药1次，正常对照组和模型对照组组灌胃生理盐水，各组连续给药42 d。
1.4 标本采集采用代谢鼠笼收集小鼠24 h尿；小鼠尾巴取血检测药前、药后的FBG；末次给药后小鼠拔眼球取血，以3500 r·min-1离心10 min，取血清待测。取小鼠肾脏组织用4%甲醛固定，常规石蜡包埋，进行HE染色。
1.5 指标检测 1.5.1 FBG测定小鼠尾静脉取血，用血糖仪和试纸测定。
1.5.2 血清Cr 、BUN和24 h尿蛋白检测采用全自动生化分析仪进行测定。
1.5.3 肾脏组织SOD、GSH-Px活性和MDA、CAT、ROS水平测定小鼠取材时摘取新鲜肾脏组织，取部分组织用生理盐水制成10%匀浆，取上清液试剂盒法测定SOD、MDA和GSH-Px；ELISA法检测CAT、ROS的含量。
1.5.4 蛋白免疫印迹法检测检测肾皮质中Cyto-C、AIF、caspase-3的蛋白表达。
1.5.5 肾脏组织的病理学检测常规石蜡包埋，进行HE染色。
1.6 统计学处理采用统计学软件SPSS 16.0对所有数据进行分析，结果以均数±标准差(x±s)表示，经方差齐性检验，方差齐者采用t检验，方差不齐者采用矫正t检验进行统计处理。
2 结果 2.1 小鼠一般状态的观察与正常对照组相比，小鼠尾静脉注射120 mg·kg-1 STZ的72 h内，逐渐出现多饮、多尿、毛发松散、精神较萎靡；42 d后，模型组小鼠体质量较正常组小鼠有所下降，其一般状态未有明显改善。与模型组比较，缬沙坦组和杨桃根各给药组的小鼠一般状态均有所改善。
2.2 EACR对糖尿病小鼠FBG的影响由Tab 1可知，与正常组比较，模型组FBG明显升高(P＜0.01)。与模型组比较，EACR中、高剂量组的FBG均有所下降，其中EACR各剂量组的FBG下降呈剂量依赖性。
| Group | Dose /g·kg-1 |
FBG/mmol·L-1 | |
| Pre-treatment | 42 d post treatment | ||
| Normal control | 6.45±2.13 | 7.41±1.48 | |
| Model control | 20.35±2.74* | 28.27±2.54* | |
| Valsartan | 0.02 | 21.34±4.41* | 29.48±5.21* |
| EACR | 0.3 | 20.58±6.21* | 27.19±4.02* |
| 0.6 | 19.54±6.22* | 21.64±4.00*Δ | |
| 1.2 | 19.95±5.54* | 16.28±5.38*Δ | |
| *P＜0.05 vs normal control;ΔP＜0.05 vs model control | |||
由结果可知，与正常组比较，模型组小鼠的BUN、Cr和尿蛋白值明显升高(P＜0.05)。与模型组比较，缬沙坦组以及EACR中、高剂量组肾功能指标的水平明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见Tab 2。
| Group | Dose/g·kg-1 | BUN/mg·dL-1 | Cr/mg·dL-1 | 24 h urine volume/mL | Urinary protein/mg·d-1 |
| Normal control | - | 17.21±1.7 | 0.42±0.064 | 0.68±0.03 | 2.63±0.18 |
| Model control | - | 27.13±2.3* | 0.56±0.063* | 2.74±0.37* | 6.97±0.47* |
| Valsartan | 0.02 | 20.11±2.6*Δ | 0.45±0.040Δ | 1.41±0.19*Δ | 4.83±0.33*Δ |
| EACR | 0.3 | 27.59±2.3* | 0.51±0.058* | 2.53±0.52* | 5.68±0.23*Δ |
| 0.6 | 25.95±3.4* | 0.47±0.075*Δ | 2.29±0.35*Δ | 5.71±0.42* | |
| 1.2 | 24.00±3.7*Δ | 0.47±0.051*Δ | 1.87±0.21*Δ | 4.10±0.26*Δ | |
| *P＜0.05 vs normal control;ΔP＜0.05 vs model control | |||||
与正常组比较，模型组小鼠肾脏组织中SOD和GSH-Px活性明显下降，MDA含量升高(P＜0.05)。与模型组比较，缬沙坦组以及EACR中、高剂量组的SOD和GSH-Px活性升高，MDA水平明显降低，但EACR低剂量组无明显改变。见Tab 3。
| Group | Dose/g·kg-1 | SOD/kU·g-1 | MDA/mmol·g-1 | GSH-Px/kU·g-1 |
| Normal control | - | 316.02±24.40 | 6.84±1.19 | 672.36±119.26 |
| Model control | - | 196.38±13.27* | 15.77±3.18* | 486.24±100.28* |
| Valsartan | 0.02 | 276.05±33.05*Δ | 8.46±3.36Δ | 625.10±140.30*Δ |
| EACR | 0.3 | 206.24±30.24* | 16.04±4.14* | 509.11±79.54* |
| 0.6 | 216.86±21.54* | 14.13±2.37* | 549.24±164.32*Δ | |
| 1.2 | 245.01±18.97*Δ | 10.24±2.21*Δ | 610.05±128.06*Δ | |
| *P＜0.05 vs normal control;ΔP＜0.05 vs model control | ||||
与正常组比较，模型组小鼠肾脏组织ROS的含量明显上升，CAT的含量明显下降(P＜0.05)。与模型组比较，EACR中、高剂量组ROS的含量明显降低，CAT的含量明显升高。见Tab 4。
| Group | Dose/g·kg-1 | CAT/MU·g-1 Pro | ROS/kU·L-1 |
| Normal control | - | 11.38±1.57 | 209.08±31.73 |
| Model control | - | 6.51±1.34* | 396.27±34.51* |
| Valsartan | 0.02 | 13.59±3.06*Δ | 251.13±33.98*Δ |
| EACR | 0.3 | 7.14±1.88*Δ | 391.25±21.71*Δ |
| 0.6 | 10.52±1.65Δ | 337.67±35.26*Δ | |
| 1.2 | 12.63±2.41*Δ | 286.45±29.68*Δ | |
| *P＜0.05 vs normal control;ΔP＜0.05 vs model control | |||
与正常组比较，模型组小鼠肾脏组织中Cyto-C、AIF、caspase-3的蛋白表达明显上升(P＜0.05)。与模型组比较，缬沙坦组、EACR中、高剂量组Cyto-C、AIF、caspase-3的蛋白表达明显降低。见Tab 5、Fig 1。
| Group | Dose/g·kg-1 | Cyto-C | AIF | caspase-3 |
| Normal control | - | 0.07±0.02 | 0.27±0.07 | 0.12±0.05 |
| Model control | - | 0.46±0.07* | 0.62±0.12* | 0.85±0.17* |
| Valsartan | 0.02 | 0.18±0。05*Δ | 0.43±0.11*Δ | 0.38±0.08*Δ |
| EACR | 0.30 | 0.41±0.13* | 0.59±0.08* | 0.76±0.13*Δ |
| 0.60 | 0.35±0.09*Δ | 0.55±0.07*Δ | 0.62±0.12*Δ | |
| 1.20 | 0.22±0.06*Δ | 0.46±0.13*Δ | 0.45±0.09*Δ | |
| *P＜0.05 vs normal control;ΔP＜0.05 vs model control | ||||
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| Fig 1 Effects of EACR on expressions of Cyto-C,AIF and caspase-3 in kidney tissues of diabetic mice A: Normal control group; B: Model control group; C: Valsartan control group; D: Low dose of EACR group; E: Moderate dose of EACR group; F: High dose of EACR group |
肾脏组织HE染色可见，正常对照组小鼠肾脏组织中细胞结构紧密、完整，肾小球结构饱满。模型对照组中肾小球萎缩，肾小管空泡变性；给药组小鼠的肾脏组织形态较模型组有一定的改善。见Fig 2。
|
| Fig 2 Histological observations of kidney tissues (HE staining×400) A: Normal control group; B: Model control group; C: Valsartan control group; D: Low dose of EACR group; E: Moderate dose of EACR group; F: High dose of EACR group |
糖尿病肾病(DN)为糖尿病患者常见的慢性并发症，患者出现严重的代谢紊乱，发展到末期肾病会严重影响其生存质量。DN发病机制与晚期糖基化终产物(AGEs)累积、炎症反应和氧化应激作用等途径有关[8]。
在正常的生理状态下，一定浓度的ROS是维持细胞正常生命活动所必需的物质，参与正常的细胞增殖、凋亡以及Ca2+储存等生理过程的调节。但是机体在病理状态下，机体的ROS浓度升高，可造成机体中蛋白质、DNA和脂质过氧化损伤[9]。在高糖状态下，细胞内NADH /NAD+比率增加，由NADH或FADH2通过呼吸链电子传递体传递的电子漏出增多，ROS产生增加[10]。同时高血糖还可导致抗氧化酶活性表达下降，清除氧自由基能力下降，进一步导致机体内ROS的增多及积聚，导致恶性循环，进而引起细胞的氧化应激损伤。
研究表明[11]，高糖所致线粒体内ROS增多可引起线粒体内膜脂质和蛋白损伤，诱导内膜流动性和通透性改变，通透性转换孔(mPTP)开启，破坏线粒体膜电位并使线粒体内渗透压改变，使线粒体发生肿胀，ATP 合成下降[12]；促使线粒体基质内促凋亡因子CytoC、DIABLO和AIF等外流，在胞质内激活caspase依赖和非依赖性凋亡途径[13]，最终导致足细胞凋亡、系膜细胞外基质堆积及肾小球基底膜增厚[14]。
临床上DN主要的治疗方案是通过控制血糖的升高，调节血脂代谢以及替代治疗，要根据病程、病期及患者的自身特点制定个体优化方案。中药在防止DN的方针中主要以延缓DN的发生发展和改善其肾脏功能为出发点[15]。我们近期研究发现，杨桃根总提取物(EACR)不仅能降低糖尿病小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和FFAs的含量，还可调节凋亡相关蛋白的表达，从而改善糖尿病小鼠的代谢功能和抑制胰腺组织凋亡。故现深入研究，EACR对糖尿病小鼠STZ所致的肾损伤是否有保护作用。
本实验研究结果发现，EACR能明显降低糖尿病小鼠血清中Cr、BUN和尿液中尿蛋白的水平，升高肾脏组织中抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，以及降低组织中ROS、MDA含量，下调肾组织中Cyto-C、AIF、caspase-3的蛋白表达，并改善肾脏组织的病理学变化。提示杨桃根总提取物其作用机制可能为降低ROS的含量及提高抗氧化因子的活性，下调促凋亡因子Cyto-C、AIF、caspase-3的蛋白表达，缓解高糖所致的氧化应激对肾脏组织所造成的损伤，从而起到肾脏的保护作用。
( 致谢: 本文实验在广西医科大学药学院中心实验室完成，黄仁彬教授设计并指导实验研究，在范氏泰和，韦晓洁和覃妮的协助下完成实验。 )
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