2. 安徽人口职业学院基础医学教研室，安徽 池州 247009;
3. 安徽中医药大学中医基础学教研室，安徽 合肥 230038
2. Dept of Basic Medicine, Anhui Vocational Institute of Population, Chizhou Anhui 247009, China ;
3. Dept of Basic Theory of Chinese Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230038, China
近年来研究发现，由于存在胰岛素抵抗和胰岛功能缺陷，加之饮食控制不佳、用药不当等原因，糖尿病患者除表现为高血糖外，还常出现明显血糖波动，表现为血糖水平在波峰和波谷之间持续震荡的一种不稳定状态[1]。大量研究表明，血糖波动较持续性高血糖更易诱导胰岛β细胞凋亡，加重胰岛功能障碍，这也是糖尿病胰岛功能进行性减退的主要原因之一[2]。然而，目前临床仍无有效措施完全克服糖尿病患者血糖水平波动。因此，抑制血糖波动所致的胰岛β细胞凋亡，就成为保护胰岛功能、延缓糖尿病发生发展和改善糖尿病预后的有效措施。
丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)是从唇形科植物丹参中提取的水溶性成分，具有抗氧化、抑制血小板聚集等多种药理活性[3]。近年来研究发现，Sal B可明显改善2型糖尿病糖脂代谢紊乱[4]，并可有效改善糖尿病肾病、动脉粥样硬化等多种并发症[3]，但对其确切机制至今仍未明确。本研究采用体外培养的大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)，观察Sal B对间歇性高糖诱导的INS-1细胞凋亡及胰岛素分泌的影响，并探讨其可能机制，阐明Sal B改善糖尿病作用机制，以为临床用于防治糖尿病提供依据。
1 材料 1.1 药物与试剂INS-1细胞株，上海艾睿生物科技有限公司；Sal B(>98%)，南京春秋生物工程有限公司； RPMI 1640培养基、胎牛血清，Hyclone公司；β-actin、p-JNK抗体，Abcam公司；JNK抗体、辣根过氧化物酶标记二抗、蛋白定量试剂盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒，碧云天生物技术研究所；胰十二指肠同源盒-1(pancreatic and duodenal homeobox-1，PDX-1)抗体，CST公司；细胞凋亡检测试剂盒，上海贝博公司；其余试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器高速冷冻离心机(5417 R)，德国Eppendorf公司；Thermo Fisher多功能酶标仪，芬兰Thermo有限公司；流式细胞仪，美国BD公司；PowerPac300 型电泳仪、Mini PROTEAN 转膜系统，美国Bio Rad公司；FluorChem FC3 化学发光凝胶成像系统，美国ProteinSimple公司。
2 方法 2.1 细胞培养INS-1细胞在37℃、5% CO2、饱和空气湿度条件下培养于RPMI 1640培养基中(含10%胎牛血清、11.1 mmol·L-1葡萄糖、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1链霉素、1 mmol·L-1丙酮酸钠、50 μmol·L-1 β-巯基乙醇)，待细胞生长至近融合时，0.25%胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行以下实验。
2.2 细胞活力检测细胞活力采用MTT法检测。INS-1细胞接种于96孔培养板(1×104/孔)，24 h后更换培养液。细胞随机分为对照组(Control)、间歇性高糖组(IHG)、Sal B高(Sal B 10 μmol·L-1)、中(Sal B 1.0 μmol·L-1)、低剂量组(Sal B 0.1 μmol·L-1)。Sal B各组加入相应浓度Sal B预孵24 h。除对照组外，其余各组加入高浓度葡萄糖(33.3 mmol·L-1)，孵育12 h，更换为普通浓度葡萄糖(11.1 mmol·L-1)，持续12 h，连续3 d。每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μL孵育4 h。弃培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，震荡混匀，570 nm测定吸光度(OD)值。
2.3 胰岛素分泌功能检测INS-1细胞以1×105/孔的密度接种于24孔培养板，细胞分组及处理同2.1项下。弃培养液，PBS洗涤后加入含5.6 mmol·L-1葡萄糖的Hanks液，37℃孵育30 min。弃培养液，分别加入含5.6 mmol·L-1和16.7 mmol·L-1葡萄糖的Hanks液孵育1 h，收集上清液，ELISA法检测胰岛素含量。
2.4 细胞凋亡水平检测INS-1细胞以1×106/孔的密度接种于6孔培养板，细胞分组及处理同2.1项下。弃培养液，0.25%胰酶消化后将细胞收集于离心管中，预冷PBS洗涤2次，每管加入Annexin V结合液400 μL悬浮细胞。在细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC染色液，混匀，4℃避光孵育15 min，再加入10 μL PI染色液，4℃避光孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡水平。
2.5 Western blot检测将INS-1细胞接种于6孔培养板(1×106/孔)，细胞分组及处理同2.1项下。收集细胞后RIPA裂解液冰浴裂解细胞，12000 g、4℃离心15 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白，转膜、封闭后分别加入JNK、p-JNK、PDX-1和β-actin抗体4℃孵育过夜，TBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，ECL发光显色，凝胶图像分析系统拍照并分析条带光密度，结果以p-JNK/JNK和PDX-1/β-actin表示。
2.6 细胞内ROS水平测定INS-1细胞以接种于96孔培养板(1×104/孔)，细胞分组及处理同2.1项下。弃培养液，PBS洗涤后加入含10 μmol·L-1二氯荧光素二乙酯(dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)的无血清培养液，37℃孵育20 min。弃培养液，无血清培养液洗涤细胞3次，荧光酶标仪检测各孔荧光强度(激发波长488 nm，发射波长525 nm)。
2.7 统计学处理计量资料以x±s表示，采用SPSS 16.0统计软件进行分析。组间比较应用单因素方差分析和LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果 3.1 Sal B对INS-1细胞活力的影响由Fig 1可见，暴露于间歇性高糖72 h后，INS-1细胞活力较对照组明显下降(P＜0.01)，而与Sal B预孵可明显提高INS-1细胞活力(P＜0.05或P＜0.01)，提示Sal B可有效减轻间歇性高糖诱导的INS-1细胞损伤(Fig 1)。
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| Fig 1 Effect of Sal B on viability of INS-1 cells (x±s,n=8) **P＜0.01 vs Control group; #P＜0.05,##P＜0.01 vs IHG group |
由Fig 2可见，基础状态下INS-1细胞胰岛素分泌水平较低，而在高浓度葡萄糖(16.7 mmol·L-1)刺激下，其胰岛素分泌量明显增加。当暴露于间歇性高糖72 h后，INS-1细胞基础状态和葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平均明显下降(P＜0.01)，提示间歇性高糖损伤了INS-1细胞胰岛素分泌功能；与Sal B预孵可明显提高INS-1细胞基础状态和葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平(P＜0.05或P＜0.01)，提示Sal B可有效改善间歇性高糖诱导的INS-1细胞胰岛素分泌功能损伤。
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| Fig 2 Effect of Sal B on insulin secretion capacity in INS-1 cells (x±s,n=6) **P＜0.01 vs Control group; #P＜0.05,##P＜0.01 vs IHG group |
正常培养条件下，INS-1细胞凋亡水平较低，而给予间歇性高糖刺激72 h后，细胞凋亡率明显升高(P＜0.01)，表现为凋亡早期和凋亡晚期细胞均明显增加；与Sal B预孵可明显抑制间歇性高糖诱导的INS-1细胞凋亡(P＜0.05或P＜0.01)，这一结果与Sal B增强INS-1细胞活力、促进胰岛素分泌作用一致，提示Sal B减轻间歇性高糖诱导的INS-1细胞损伤、改善胰岛素分泌功能与抑制细胞凋亡有关(Fig 3)。
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| Fig 3 Effect of Sal B on INS-1 cell apoptosis (x±s,n=4) A~E: Representative flow cytometric dot plots. A: Control; B: IHG; C: Sal B (10 μmol·L-1); D: Sal B (1 μmol·L-1); E: Sal B (0.1 μmol·L-1); F: Apoptotic rate of INS-1 cells. **P＜0.01 vs Control group; #P＜0.05,##P＜0.01 vs IHG group |
由Fig 4可见，正常培养条件下，INS-1细胞JNK活化水平较低，而暴露于间歇性高糖72 h后，JNK活化水平明显升高(P＜0.01)，说明间歇性高糖可明显诱导JNK活化。当INS-1细胞与Sal B预孵后再暴露于间歇性高糖时，JNK活化水平明显下降(P＜0.05或P＜0.01)，这一作用与Sal B抑制INS-1细胞凋亡作用一致，提示Sal B抑制间歇性高糖诱导的INS-1细胞凋亡与抑制JNK活化有关。
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| Fig 4 Effect of Sal B on JNK activation in INS-1 cells (x±s,n=4) **P＜0.01 vs Control group; #P＜0.05,##P＜0.01 vs IHG group |
暴露于间歇性高糖72 h后，INS-1细胞PDX-1蛋白表达水平明显下降(P＜0.01)，而与Sal B预孵可明显提高INS-1细胞PDX-1蛋白水平(P＜0.05，P＜0.01)，这一结果与Sal B抑制INS-1细胞凋亡、增加胰岛素分泌作用一致，提示Sal B减轻间歇性高糖诱导的INS-1细胞损伤与上调PDX-1蛋白表达有关，见Fig 5。
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| Fig 5 Effect of Sal B on PDX-1 proteinexpression in INS-1 cells (x±s,n=4) **P＜0.01 vs Control group; #P＜0.05,##P＜0.01 vs IHG group |
由Fig 6可见，暴露于间歇性高糖72 h后，INS-1细胞内ROS水平明显升高(P＜0.01)，而与Sal B预孵后再暴露于间歇性高糖，细胞内ROS水平明显下降(P＜0.05或P＜0.01)。
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| Fig 6 Effect of Sal B on intracellularROS in INS-1 cells (x±s,n=8) **P＜0.01 vs Control group; #P＜0.05,##P＜0.01 vs IHG group |
高血糖是糖尿病最典型的临床特征之一，长期高血糖一方面可引起各种急慢性并发症，另一方面又可诱导胰岛β细胞凋亡，导致胰岛素分泌进一步减少，血糖进一步升高，形成恶性循环。同时，由于胰岛功能减退，葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力明显下降，加之广泛存在的胰岛素抵抗，致使餐后血糖水平常明显升高，引起血糖剧烈波动[5]。大量研究表明，血糖波动较持续性高血糖更易诱导胰岛β细胞凋亡，加重胰岛功能障碍，且血糖波动幅度越大，糖尿病预后越差，这也是糖尿病病情进行性加重的主要原因之一[6]。因此，有效抑制血糖波动所致的胰岛β细胞凋亡将是改善糖尿病及其并发症的有效措施之一。本研究结果显示，暴露于间歇性高糖72 h后，INS-1细胞凋亡水平明显升高，细胞活力和胰岛素分泌能力均明显下降，这一结果与文献报道一致[7]。与Sal B预孵可明显抑制间歇性高糖诱导的INS-1细胞凋亡，提高细胞活力和胰岛素分泌能力，提示Sal B可有效抑制间歇性高糖诱导的胰岛β细胞凋亡，改善胰岛功能，这一发现与体内研究结果基本一致[8]。由于本研究采用了更符合糖尿病临床特点的间歇性高糖环境，因此该研究结果可更客观地反映Sal B在体内对胰岛β细胞的保护作用，这为应用Sal B改善糖尿病胰岛功能提供依据。
大量研究表明，高血糖引起胰岛β细胞凋亡的机制与诱导氧化应激有关[9]。高血糖尤其是间歇性高糖可通过多种途径促进ROS产生，并可损伤机体抗氧化酶活性，诱导氧化应激状态[10]。由于胰岛β细胞表达的抗氧化酶水平较低，故其更易受到氧化应激损伤[11]。ROS既可直接损伤细胞生物膜中多不饱和脂肪酸及胞内蛋白质、DNA等生物大分子，诱导细胞凋亡，也可通过激活应激敏感性信号通路，启动细胞凋亡进程[12]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员之一，与多种疾病的发生发展密切相关。ROS可通过直接或间接等多种途径激活JNK信号通路，活化的JNK一方面可促进Fas L、Bim等促凋亡蛋白表达，另一方面可抑制Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白表达，从而导致线粒体膜通透性增加，细胞色素C等凋亡诱导因子从线粒体释出，启动凋亡进程[13]。体外研究显示，抗氧化剂可有效抑制高血糖诱导的JNK活化和胰岛β细胞凋亡[14]，这些发现为应用抗氧化剂改善糖尿病胰岛功能提供了依据。本研究结果显示，暴露于间歇性高糖72 h后，INS-1细胞内ROS和JNK活化水平均明显升高，这一结果与文献报道一致[15]。当INS-1细胞与Sal B预孵后再暴露于间歇性高糖时，细胞内ROS和JNK活化水平均明显低于间歇性高糖对照组，说明Sal B可明显抑制间歇性高糖诱导的ROS产生和JNK活化，这一作用与Sal B抑制INS-1细胞凋亡作用一致，提示Sal B抑制间歇性高糖诱导的INS-1细胞凋亡与改善氧化应激状态、抑制JNK活化有关。本研究从ROS-JNK信号通路初步揭示了Sal B抑制INS-1细胞凋亡的分子机制，这一结果将为进一步探讨Sal B保护糖尿病胰岛β细胞的机制奠定基础。
此外，本研究结果还显示，间歇性高糖可明显抑制胰十二指肠同源盒-1(PDX-1)蛋白表达。作为胰岛β细胞特异表达的转录因子，PDX-1具有抑制β细胞凋亡、促进胰岛素合成及分泌等多种生理作用，是维持胰岛正常功能的重要因素之一[16]。ROS可减少PDX-1 mRNA表达，降低PDX-1与胰岛素启动子结合活性，下调胰岛素基因转录[17]。活化的JNK也可磷酸化PDX-1并使其发生核质易位，抑制胰岛素基因转录，导致胰岛素合成和分泌减少[18]。Sal B可明显提高INS-1细胞PDX-1蛋白水平，提示Sal B抑制INS-1细胞凋亡、改善胰岛素分泌能力，与改善氧化应激状态、增加PDX-1表达有关。
综上所述，本研究采用了更符合糖尿病临床特点的间歇性高糖环境，从ROS介导JNK活化信号通路揭示了Sal B对INS-1细胞凋亡的抑制作用及其分子机制。该研究为进一步阐明Sal B改善糖尿病胰岛细胞功能的机制奠定基础，并将为临床应用于改善糖尿病胰岛功能提供依据。
( 致谢: 本实验在皖南医学院药理学教研室中药药理三级实验室完成，在此表示感谢。 )
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