2. 安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥 230031;
3. 省部共建新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230031
2. Anhui Key Laboratory for Research and Development of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230031，China ;
3. Key Laboratory of Xin’an Medicine，Ministry of Education，Hefei 230031，China
在多细胞生物中，细胞间的通讯对不同类型细胞的正常功能是必不可少的，细胞通过不同的机制交换信息。过去几年，实验和临床证据表明[1]，细胞释放的细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)可通过直接接触，与质膜融合或内吞作用进入细胞进行细胞通讯。其中，外泌体(exosomes)作为EVs的一个亚群，可促进多肽、microRNA(miRNA)、mRNA和线粒体DNA在细胞和组织之间交换，在许多生理和病理过程中扮演着重要作用，可以作为多种心血管疾病的诊断标志物[2]。
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是公认的一种慢性炎症性疾病[3]，AS的病灶积累了大量免疫细胞、血小板、血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)、平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)来源的外泌体。许多证据表明，EVs在AS发生，发展和并发症的各个阶段发挥着作用，并在AS中介导炎症，氧化应激和细胞凋亡起到关键作用[4]。已有初步研究结果解释外泌体在体内的运输途径，但关于其介导的细胞间的信号传导的功能研究仍需进一步探索[5]。对含有已知蛋白质和遗传物质外泌体的认识有助于我们进一步研究在AS发病过程中不同细胞间的通讯联系的分子机制。
1 外泌体 1.1 来源细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的EVs主要由外泌体、微囊泡(microvesicles，MVs)和凋亡小体(apoptotic bodies)组成。直径从30~120 nm的外泌体在核内体系统中形成，与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外。MVs是由细胞膜直接脱落至胞外形成，直径0.1~1 μm，也被称为微粒(microparticles)。细胞凋亡分泌内含胞质、细胞器及核碎片的小体称为凋亡小体，直径1~4 μm[6]。外泌体与其他两种EVs大小和形成机制不同，但直径在100 nm左右的MVs与外泌体难以区分，因此，很多研究将直径为100 nm的膜性囊泡结构均称为外泌体。目前发现，几乎所有类型的细胞都可以释放外泌体，外泌体广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，体内成像也证实外泌体体内广泛的传递性[7]。
1.2 特性和功能与直接细胞间接触或分泌因子相比，外泌体可以以更有效的方法影响受体细胞。既往外泌体只被认为是细胞的“垃圾袋”，让细胞摆脱一些无用和错误折叠的蛋白，但在最新研究中发现，外泌体所携带的的“货物”具有重要的生物学意义。外泌体的内含物随细胞状态的变化而变化，携带母细胞表面的蛋白和胞质内的组分，从而引起细胞内的生理变化，表面标志物的表达可用于识别外泌体的来源细胞类型[8]。虽然外泌体形成过程已大致确定，但是这个过程的精确分子机制以及外泌体所携带的“货物”的组成和其功能依然有很多未知。不同细胞来源的外泌体在生理和病理以及应激条件的状态下的内容物会不同，外泌体携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等[9]。外泌体表面蛋白都会含有以下几种物质：MHC Ⅰ/Ⅱ类分子、热休克蛋白(HSP70、HSP90)、四跨膜家族蛋白(CD63、CD9、CD81、CD82等)、整合素、细胞骨架蛋白以及一些生物酶类。外泌体中发现的多种RNA类型，其中包括mRNA、miRNA、tRNA、rRNA、vaultRNA、circRNA、Y RNA、lncRNA以及sncRNA。RNA被包裹在脂质双层膜中，一旦释放到细胞外环境，可以保护它免受RNA酶消化。也有少数报道指出，某些特殊来源的外泌体也会包含DNA分子[1]。外泌体可以通过包裹脂质、蛋白和核酸在细胞外环运输到受体细胞，调节受体的功能，尤其外泌体所包含的许多RNA分子已被证实会参与到一些疾病发生过程。外泌体具有药理的调节作用，其中包括：(1)激活靶细胞受体随后激活细胞内特定受体；(2)转移分子到靶细胞从而改变其表型；(3)被用于运输药物并因此携带特定的分子靶向特定细胞[10]。
2 AS不同细胞来源的外泌体的作用 2.1 免疫细胞来源的外泌体在AS其病理进展过程中，固有免疫应答在AS的发生和发展中起重要作用，大量免疫细胞如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cells，DCs)、T淋巴细胞等均存在于AS斑块组织中，这些免疫细胞是机体抵御微生物和异物入侵的第一道防线，通过分泌促炎和抗炎细胞因子、趋化因子来影响AS 的病理过程[3]。这些免疫细胞来源的外泌体在AS的发生发展中发挥着重要的作用，参与细胞间交流并且可以介导免疫反应。免疫细胞分泌的外泌体组成了AS的特殊的微环境，并且调节AS中的免疫反应[11]。
2.1.1 单核/巨噬细胞来源的外泌体相当多的证据支持单核/巨噬细胞在AS早期参与先天免疫反应，在人体动脉标本和AS的许多实验模型观察发现单核细胞浸润为AS的早期事件。单核细胞是巨噬细胞和DCs的祖细胞，它们被主动招募到AS病变位点，并且通过维持慢性的炎症反应来促进AS斑块发展[3]。邻近体液细胞的外泌体可以通过Toll样受体信号促进炎性细胞因子的分泌来激活单核细胞[11]。VECs损伤、迁移是心血管疾病发生发展的重要因素。巨噬细胞和淋巴细胞可以进入损伤部位并且协同浸润血管内膜，外泌体介导巨噬细胞和淋巴细胞炎症的激活可能会让血管壁浸润。胆固醇诱导巨噬细胞来源较大的EVs可以通过细胞间黏附分子(intracellular adhesion molecule，ICAM-1)的升高和NF-κB的活化促进白细胞滚动。单核/巨噬细胞及其分泌的外泌体附近的大多是动脉VECs，所以单核细胞可通过分泌外泌体直接诱导内膜浸润，并且诱导VECs凋亡和通过组织因子的释放促进凝血，导致VECs进一步损伤[12]。单核细胞在IFN-α和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的刺激下，其分泌的外泌体包含的ICAM-1、CCL-2、IL-6的含量有所上升，这些带有炎性因子的外泌体被人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)摄取后会激活TLR4和NF-κB通路造成内皮功能紊乱[13]。巨噬细胞来源的外泌体通过抑制整合素转运介导HUVECs迁移，溶酶体降解抑制剂bafilomycin A可以阻断此过程。同时，巨噬细胞来源的外泌体也被证明能有效地抑制胶原蛋白诱导的MAPK/ERK通路来调节HUVECs的迁移[14]。
外泌体中的miRNA也发挥着重要作用。VECs与单核/巨噬细胞之间可以通过循环EVs的RNA的传递增强通信[11]。巨噬细胞分泌的EVs中的RNA分子被运送到到各种靶细胞中，包括单核细胞、成纤维细胞、VECs等。巨噬细胞EVs通过miRNA-223诱导自身分化和炎症反应[15]。在AS中的炎症因子作用下，巨噬细胞来源的外泌体包含大量促进炎症的miRNA-19、miRNA-21、miRNA-133、miRNA-155等[16]。巨噬细胞受到刺激后，会增加外泌体中miRNA-150的分泌，miRNA-150水平的升高可有效地降低c-Myb蛋白的表达，增强人微血管内皮细胞(HMEC-1)的迁移。进一步研究显示，从AS患者血浆中分离出的EVs含有较高水平的miRNA-150，这些EVs比从健康人分离的EVs更能有效促进HMEC-1的迁移。miRNA可以通过EVs的形式进入VECs促进其凋亡、迁移，诱导AS的发生，促进心血管疾病的发生[17]。
2.1.2 树突细胞来源的外泌体DCs存在于正常动脉壁中，而在AS病变部位 DCs数量增多。循环中的DCs会进入内膜下，摄取ox-LDL抗原后形成成熟DCs，通过向T细胞提呈抗原肽段而启动针对ox-LDL的适应性免疫应答，一定程度上消除ox-LDL的致病作用[18]。有研究指出，DCs来源的外泌体不被T细胞内吞，但是他们可以通过运送细胞表面受体从而调节T细胞基因的表达和功能的激活[19]。DCs来源的外泌体同样包含有DCs相似的表达分子，例如其外泌体表面可以高表达MHC Ⅰ/Ⅱ类分子、CD80、CD86以及与胞吞作用有关的分子膜联蛋白Ⅱ、RabS/Rab7、Tsg101等，并能通过MHC类分子被未接触抗原的DCs所摄取。DCs分泌高水平的外泌体会与抗原特异性CD4+ T淋巴细胞相互作用，从而产生适应性免疫应答[20]。未成熟和成熟的DCs诱导不同程度的T细胞反应，在LPS刺激DCs分泌的外泌体与未成熟的DCs分泌的外泌体相比有50-100倍更有效的体外诱导抗原特异性T细胞活化。蛋白质组学和生化分析表明，成熟DCs的外泌体与未成熟DCs的外泌体相比富含MHC Ⅱ类分子、B7.2、ICAM-1、MFG-E8[21]。DCs源性外泌体主动调节免疫，能起到缓解AS进展的作用，可能通过降低非HDL的含量，升高HDL的含量，增加胆固醇的逆转运起到调节血脂的作用。DCs源性外泌体在其表面表达的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)可能进一步导致VECs出现凋亡。在降血脂药阿托伐他汀刺激骨髓DCs后，DCs分泌的外泌体可以通过调节IDO/Treg和FasL/Fas改善免疫性重症肌无力等自身免疫性实验鼠的病症[22]。
2.1.3 T细胞来源的外泌体T细胞是机体中循环的一种白细胞，其可以帮助清除细胞的异常和感染。动脉外膜是T细胞的主要积聚场所，组织学研究发现外膜可能有助于适应和固有免疫应答来调节AS[23]。而T细胞来源的外泌体也在适应性免疫反应和AS形成中起着重要的作用。来源于T细胞的外泌体有T细胞表面受体蛋白，可以直接介导淋巴细胞和巨噬细胞之间的通讯，活化的CD4+T细胞源性外泌体可以通过磷脂酰丝氨酸受体，促进单核细胞内的脂质聚集。活化的T细胞多泡体(外泌体释放作为手段)可以增加FasL和TRAIL的表达，炎症状态下可以促进外泌体介导的细胞凋亡的发生[24]。同样，T细胞发生凋亡时产生的EVs可以通过抗氧化作用减少ROS的生产。在细胞凋亡的早期阶段，T细胞来源的EVs由于其转运抗氧化酶CAT和SOD等的能力可作为ROS清除剂。被VECs内化后，这些EVs能够上调MnSOD的表达[25]。T细胞外泌体中也含有丰富的miRNA，Treg可以释放的含有miRNA的外泌体，这些miRNA能转运到Th1细胞，抑制Th1细胞的增殖和IFN-γ的释放[26]。
2.2 血小板来源的外泌体血小板不仅具有促进血栓形成的作用，而且是炎症和AS的重要关联体。被激活后的血小板和血小板微粒可与免疫细胞通过表达和释放炎症介质，诱导免疫细胞的炎症作用，促进VECs活化及变性，形成AS和血管血栓性病变[27]。
含有P-选择素和CD63的血小板EVs可反映血小板活化的外周动脉疾病，活化的血小板有助于循环EVs不断释放，AS患者有循环EVs水平增加，循环miRNA也能作为血小板活化的分子标志物。循环系统中的外泌体主要源于血小板，血小板来源的EVs可以影响血小板和VECs的功能，具有血管损伤作用，尤其还能正反馈激活其他血小板并促进粘附血管壁，导致血栓形成[28]。被激活的血小板释放的EVs，可以诱导VECs产生ICAM-1及炎性细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8，导致单核细胞对VECs的粘附。血小板源性MVs可以诱导VSMCs增生促进AS的形成，并通过NF-kB增加单核细胞粘附到VECs，诱导VECs炎性反应[29]。富血小板血浆外泌体还可通过NADPH活性升高氧化还原代谢失常加剧VECs和VSMCs的凋亡。在LPS环境下血小板分泌的外泌体可使体外培养的VECs和VSMCs生成过氧化物、NO以及亚硝酸盐，激活caspase-3，诱导细胞凋亡，提示在病理环境下的血小板源性外泌体可通过氧化还原信号途径，介导血管损伤。同样从感染性休克患者和健康者血浆中分离出血小板源性外泌体也有同样的作用[30]。但是也有相关报道证实[31]，富血小板血浆外泌体通过减少巨噬细胞CD36的表达降低ox-LDL和脂质负荷，抑制血小板血栓的形成来减缓AS，同时外泌体可提高CD36蛋白的泛素化和增加的蛋白酶体的降解。通过使用酪氨酸激酶受体Tyro3、Axl、Mer(TAMs)阻断性抗体或使用siRNA特异性敲低某个TAM，研究发现，人血小板生成的EVs可以被人主动脉内皮细胞(HAECs)和HUVECs的吞噬，这个吞噬过程主要是Axl和Gas6相互作用介导的[32]。
血小板来源外泌体富含具有调控功能的多种miRNA，其中miRNA-223、miRNA-339和miRNA-21水平与血小板活化相关，活化的血小板分泌的外泌体因含有miR-223、mir-339和miRNA-21可能转入VSMCs，减少PDGFRβ表达而抑制PDGFRβ诱导的VSMCs增殖，这些外泌体miRNA可能预测血栓形成的生物标志物[33]。抗血小板治疗能明显降低miRNA水平包括miRNA-126、miRNA-150、miRNA-191和miRNA-223。miRNA-223是血小板最丰富的miRNA随后是miRNA-126，而miRNA-223有助于血小板的反应性分泌和黏附，聚集[34]。血小板中miRNA-233在促血小板生成素或凝血酶的作用下表达明显升高，并以 EVs 的形式释放到血浆中。血小板释放的miRNA-233也可通过ILGF1R促进糖基化终产物诱导的HUVECs凋亡[35]。血小板来源外泌体miRNA-320减少内皮ICAM-1的表达，从而促进VECs的活力，减少炎症和血栓形成，可能为防止进一步损伤的一种手段[36]。
2.3 血管内皮细胞来源的外泌体内皮功能障碍被认为是AS的起始事件，且与其他心血管疾病相关。血液中存在大量的内皮微粒为0.1～1 μm的囊泡样结构。在心血管疾病的发病机制中起着重要的作用，有促进AS的作用，内皮微粒出现主要代表血管内皮损伤或功能紊乱。VECs也被证明可以产生大量外泌体，参与VECs之间、VECs与VSMCs、VECs与免疫细胞的之间串扰。他们可以进一步作为AS和VECs功能的诊断标志物[37]。正常组织附近的血管，VECs排列相对紧密，因而外泌体几乎不会通过血管渗透出去，而AS病变组织附近的血管，VECs间隙大，外泌体可通过细胞间间隙透出血管从而影响更多的VECs和VSMCs来参与AS的发生发展。采用基因芯片和定量蛋白组学技术分析不同类型的细胞应激下VECs来源的外泌体的mRNAs和蛋白含量，共发现有1354种蛋白质和1992 种mRNAs，也反映外泌体转运货物的复杂性[38]。在不同压力条件下VECs分泌的EVs的蛋白质组和转录物组会有所变化。高血糖条件下激活内皮衍生的EVs可以通过增加NADPH的活性诱导单核细胞的粘附其他VECs[39]。通过运用大规模蛋白组学，经电镜和生物化学方法鉴定，比较caspase-3激活的VECs释放的凋亡小体、MVs和外泌体的蛋白表达谱，发现循环的外泌体样囊泡中的20S蛋白酶体活性在小鼠血管损伤后增加[40]。Hcy和ox-LDL诱导增加体外培养的大鼠主动脉VECs外泌体HSP70的含量。HSP70在细胞应激反应中释放，但过高热休克蛋白水平会激活单核细胞粘附于VECs[41]。
同样含有miRNA的VECs来源的外泌体也在AS中发挥着重要作用。在VECs和VSMCs间通讯的miRNA研究发现，VECs中受KLF2调节明显升高的 miRNA-143/145可进入VSMCs抑制其靶基因ELK1和CaMMKβ表达，这两个是VSMCs表型的主要调控物，同时促进去分化和抑制VSMCs的增殖。将VECs分泌的含有 miRNA-143/145的EVs注入经高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠体内后发现，其AS主动脉斑块形成明显减缓[42]。来自缺氧诱导的VECs的外泌体被证明含有高量表达miRNA-126和miRNA-210，miRNA-126和miRNA-210增加实验诱导的心肌梗死后CPC移植NOD/SCID小鼠存活率，抑制这两种miRNA会阻断外泌体的保护作用[43]。在AS中，VECs凋亡产生的EVs富含miRNA-126，它在体内提供了内皮的保护。在ApoE-/-小鼠的AS模型中，EVs通过miRNA-126减少斑块区域和巨噬细胞的渗透，抑制AS的发展，并通过CXCL12的生产促进干细胞代谢，最终稳定硬化的斑块[44]。而对晚期斑块的稳定和逆转对AS的治疗也至关重要[45]。在外泌体介导的VECs之间，miRNA-214在控制VECs功能和血管生成中也起着主导作用，VECs来源的外泌体诱导的邻近受体细胞迁移和血管生成，而沉默miRNA-214的VECs外泌体则没有这些功能[46]。
2.4 血管平滑肌细胞来源的外泌体VSMCs的增殖和凋亡以及钙化在AS形成过程中起重要作用，血管钙化是心血管疾病的一个主要共同特征，是AS普遍存在的病理过程，也是AS的必然结果[47]。富含蛋白质和miRNA的VSMCs外泌体调节细胞黏附和迁移、炎症反应、血管损伤、血管钙化、血栓形成等[48]。
EVs参与了微钙化结构的形成并且与AS斑块破裂有关，然而目前钙化小泡的形成机制还不清楚。fetuin-A作为1个钙化作用的抑制分子被装载在细胞EVs中。Alexa488标记的fetuin-A被VSMCs获取，通过胞内体系统，从多泡小体中以外泌体的形式分泌出去，其释放是由SMPD3调节的。细胞外钙浓度的提高会诱导SMPD3的表达，促进钙化外泌体的分泌。抑制SMPD3可抑制VSMCs的钙化。在钙化的条件下，TNF-α和PDGF-BB也可以提高外泌体的生成，从而增强了VSMCs的钙化[49]。Sortilin被招募到EVs中也被认为是VSMCs钙化的关键过程。Sortilin存在于人类和小鼠AS斑块并且参与体外培养的VSMCs微钙化的形成。Sortilin调节EVs对钙化蛋白相关TNAP的装载，从而赋予其钙化潜力。此外，VSMCs钙化需要Rab11依赖的Sortilin转运和FAM20C/CK2对Sortilin C端的磷酸化修饰，所以Sortilin可能通过向EVs富集来介导血管钙化[50]。DDR-1通过TGF-β信号通路调节VSMCs纤维化并释放的钙化EVs。DDR-1敲除的VSMCs与未敲除相比会释放4倍量的EVs，同时升高碱性磷酸酶活性。DDR-1敲除的VSMCs表型的特点是矿化的增加和无定形的胶原沉积。VSMCs的钙化会增加TGF-β释放，刺激p38的磷酸化和抑制Smad3的激活，而抑制TGF-β受体或者磷酸化的p38可以逆转纤维钙化的DDR-1敲除的VSMCs[51]。VSMCs来源的外泌体释放的调制可以作为预防治疗血管钙化的新靶点。
VSMCs和VSMCs之间的相互作用在维持血管壁的平衡中起着关键的作用。体外研究表明[52]，XBP1S对VSMCs的影响可以通过VSMCs来源的EVs介导的miRNA-150转移和miRNA-150驱动的VEGF-A/VEGFR/PI3K/Akt通路控制VECs迁移，从而调节血管壁稳态的维持。
3 总结与展望综上所述，外泌体内容物主要为蛋白质及RNA，尤其是外泌体的miRNA能有效的从根本上改变受体细胞的转录组学，可能是心血管疾病中细胞间串扰的关键因素。AS患者的血管组织和血液都存在miRNA水平的改变，miRNA可以从多个方面参与AS形成的病理过程[53-54]。而外泌体携带的蛋白也是影响AS的重要原因，表面蛋白可用于识别外泌体的来源，在不同因素刺激下的外泌体也会携带抗炎或促炎因子来影响AS的发生发展。虽然对外泌体与心血管疾病关系的研究越来越多，但是外泌体所含其他内容物以及外泌体的形成与心血管疾病的关系等许多未解决的问题有待进一步探索。
作为多种信号的传递体，外泌体能够将信息传递给邻近细胞甚至远隔细胞实现基因表达。在理论上，检测血液携带的DNA、RNA、EVs和细胞残骸可以帮助人们诊断和监控各种疾病，也有望为AS的诊断、治疗、预后评估提供新的靶点。从血清分离外泌体和其它EVs往往是困难的，近年来外泌体的分离和检测领域取得了进展，系统生物学为基础的数据分析阐明所涉及的细胞和组织之间的通讯的应用，以及开发外泌体作为给药治疗载体进行研究的热点领域，都为AS的治疗提供了思路，在不久的将来，外泌体用以作为提高个体化心血管风险预测的标志物也将成为可能。
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