2. 云南省中医中药研究院中心实验室，云南 昆明 650223;
3. 云南大学化学科学与工程学院·药学院自然资源药物化学教育部 重点实验室，云南 昆明 650091;
4. 云南省中医医院中心实验室，云南 昆明 650021;
5. 云南中烟工业有限公司、云南省烟草化学重点实验室，云南 昆明 650231
2. Center Laboratory, Yunnan Institute of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica, Kunming 650223, China;
3. Key Laboratory of Tobacco Chemistry of Yunnan Province, China Tobacco Yunnan Industrial Co., Ltd, Kunming 650231, China;
4. Center Laboratory of Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650021, China;
5.
高血脂、高血糖、高血压及肥胖、高胰岛素血症是胰岛素抵抗综合征(insulin resistin syndrome)的几个表现方面。在这些疾病中，胰岛素抵抗(insulin resistin, IR)起着核心作用。脂代谢紊乱在IRS中很常见，它既是IRS的重要组成要素，也是导致冠心病等的主要危险因素，其中最特征性的血脂异常是高TG症和较低的高密度脂蛋白胆固醇。胰岛素可增加脂肪细胞的脂蛋白酶活性，当IR时，胰岛素对脂蛋白酶活性的调节作用受损，故富含TG的脂蛋白分解下降，从而降低HDL浓度，同时IR又使TG清除障碍，使TG进一步升高。可见IR是导致血脂异常的重要因素。以往的研究发现[1-2]，荜茇醇提物具有降低IRS模型大鼠空腹血糖、降低血压、TNF-α水平、防止FFA、TG水平的上升和增强模型大鼠胰岛素敏感指数的作用，同时提示有增强机体免疫功能的作用[3]；进一步研究表明[4]，胡椒碱具有降低血糖、增强胰岛素敏感指数等改善IRS大鼠糖代谢的作用。然而，胡椒碱对脂肪代谢干预作用及机制尚未阐明。基于此，通过对高脂高糖高盐构建IRS模型进行研究，探讨PIP对IRS大鼠模型脂肪代谢作用的影响及其作用机制，为开发改善IR作用的新药提供依据。
1 材料 1.1 实验动物及分组健康♂Wistar大鼠，体质量(200±20) g，共计60只，由四川医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：SCXK (川)2004-16。采取完全随机法分6组，即正常组、模型组、罗格列酮(ROG)组、PIP低、中、高3个剂量组。
1.2 实验药物 1.2.1 PIP的制备荜茇药材购自云南省药材公司，经云南中医学院杨树德教授鉴定为胡椒科植物荜茇的干燥近成熟果实及果穗。经粉碎、提取、分离及结构鉴定，制得PIP，纯度为98%。
1.2.2 阳性药ROG选用胰岛素增敏剂ROG片，使用时参照说明书，按照体表面积换算公式换算成大鼠灌胃ig给药量，临用前以生理盐水按照设定浓度稀释，置4 ℃冰箱备用，ig前放置室温并混匀。
1.3 仪器与试剂 1.3.1 仪器756型紫外-可见分光光度仪(上海光谱仪器厂)；DNM-9062G型酶标仪(北京普朗新技术有限公司)；TGL-20M高速台式冷冻离心机(湘仪离心机厂)；TGL-16B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；移液枪(德国BRAND公司)；肝素钠注射液(天津市生物化学制药厂)。
1.3.2 试剂ROG (成都恒瑞制药有限公司)；肝素钠注射液(天津市生物化学制药厂)；体积分数为0.75的乙醇(昆明远方生物制品有限公司)；吐温-80(AR级，天津市化学试剂三厂)；TG、FFA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TNF-α、Leptin试剂盒(Adlitteram Diagnostic Laboratories, lnc. ADL公司)
1.4 方法 1.4.1 给药方法各组大鼠适应性喂养1周，除正常组外，各组造模4周后开始给药，PIP各组按照15、30、60 mg·kg-1的剂量给药，阳性组给予3 mg·kg-1的ROG，正常组和模型组均给予等体积的生理盐水，本实验采用预防+治疗的方法每天定时ig给药。
1.4.2 造模方法采用高脂高糖高盐饲养复制IRS大鼠模型。高脂饲料制备方法参考文献并加以改进[8]，高脂饲料的质量比为：基础饲料0.51、糖0.24、猪油0.23、盐0.02，由昆明医科大学动物中心加工而成。普通饲料购于云南中医学院动物房。除正常组给予普通饲料外，其余各组给予高脂饲料，采取自由饮水，定时定量喂饲，造模4周后取血，测指标，判断造模情况[4]。
1.5 观察指标及测定方法 1.5.1 血清TG和FFA检测大鼠空腹，分离血清，分别采用GPO-PAP法、比色法检测TG、FFA水平，操作步骤按说明书进行。
1.5.2 TNF-α和Leptin水平检测大鼠空腹，分离血清，采用ELISA法检测TNF-α、Leptin水平，操作按说明书进行。
1.6 统计学方法计量资料以(x±s)表示，组间比较用t检验，采用SPSS 16.0统计软件处理。
2 结果 2.1 PIP对IRS模型大鼠TG水平的影响高脂饲料造模4周后，各组大鼠TG明显升高；给药4周(造模8周)后，与模型组比较，正常组TG较低，差异有统计学意义(P < 0.01)；除PIP低剂量组外，ROG组、PIP中、高剂量组均下降；给药8周(造模12周)后，与模型组比较，ROG组、PIP各剂量组TG水平较低，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)，提示PIP能降低IRS模型大鼠TG水平的作用。见Tab 1。
| Group | Dose/ mg·kg-1 |
Changes of TG/mmol·L-1 | |||
| Before model establish (n=10) |
model establish 4 wk (n=10) |
After treatment 4 wk (n=10) |
After treatment 8 wk (n=8) |
||
| Control | - | 0.61±0.23 | 0.63±0.14 | 0.92±0.33 | 0.82±0.37 |
| Model | - | 0.67±0.16 | 1.44±0.49△△ | 1.39±0.27△△ | 1.71±0.53△△ |
| ROG | 3 | 0.81±0.27 | 1.32±0.33 | 0.95±0.35** | 1.18±0.40** |
| PIP | 15 | 0.53±0.14 | 1.39±0.51 | 1.46±0.48 | 1.27±0.30* |
| 30 | 0.76±0.31 | 1.45±0.40 | 1.04±0.20* | 1.07±0.38** | |
| 60 | 0.58±0.18 | 1.54±0.41 | 1.19±0.28 | 1.19±0.26* | |
| △△P < 0.01 vscontrol; *P < 0.05, **P < 0.01 vsmodel | |||||
给药8周后，与模型组比较，各给药组大鼠FFA水平均明显低于模型组，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)，说明PIP具有降低IRS模型大鼠FFA水平的作用。见Tab 2。
| Group | Dose/mg·kg-1 | n | FFA/μmol·L-1 |
| Control | - | 8 | 846.75±414.05 |
| Model | - | 8 | 1605.70±739.64△△ |
| ROG | 3 | 8 | 921.66±443.73* |
| PIP | 15 | 8 | 917.37±454.53* |
| 30 | 9 | 861.45±452.73** | |
| 60 | 9 | 817.34±473.96** | |
| △△P < 0.01 vscontrol; *P < 0.05, **P < 0.01 vsmodel | |||
结果显示，给药8周后，与模型组比较，各给药组大鼠血清TNF-α水平明显低于模型组，差异有统计学意义(P < 0.01)，表明PIP具有降低IRS模型大鼠血清TNF-α水平的作用。见Tab 3。
| Group | Dose/mg·kg-1 | TNF-α/ng·L-1 |
| Control | - | 136.74±4.89 |
| Model | - | 257.08±13.46△△ |
| ROG | 3 | 178.95±12.28** |
| PIP | 15 | 234.14±7.92** |
| 30 | 216.35±22.72** | |
| 60 | 199.45±10.83** | |
| △△P < 0.01 vscontrol; **P < 0.01 vsmodel | ||
给药8周后，与模型组比较，各给药组大鼠血清Leptin水平明显低于模型组，差异有统计学意义(P < 0.01)，表明PIP具有降低IRS模型大鼠血清Leptin水平的作用。见Tab 4。
| Group | Dose/mg·kg-1 | Leptin/ng·L-1 |
| Control | - | 710.37±79.37 |
| Model | - | 1015.5±201.73△△ |
| ROG | 3 | 788.75±125.32** |
| PIP | 15 | 824.00±132.38** |
| 30 | 744.87±91.35** | |
| 60 | 724.00±132.38** | |
| △△P < 0.01 vscontrol; **P < 0.01 vsmodel | ||
TNF-α、Leptin、TG、FFA与IRS密切相关。炎症因子TNF-α可通过直接或间接等多种途径影响胰岛素抵抗，如诱导IRS-1丝氨酸磷酸化、降低GLUT-4的数目等，TNF-α水平升高会导致胰岛素敏感度降低而直接引起IR。同时会导致机体肝脏血脂(如TG)储藏增加，从而引起输送到肝脏的FFA浓度升高，进而使脂质过度沉积，减少胰岛素的清除导致IR。而且，TNF-α也会导致脂肪组织的慢性炎症，引起胰岛素抵抗。胰岛素和Leptin的分泌互相影响，胰岛素可促进Leptin的分泌，Leptin可引起胰岛β细胞内一些蛋白的酪氨酸磷酸化，它一方面抑制胰岛素分泌，另一方面则增加胰岛素靶组织对胰岛素的敏感性，脂肪组织在Leptin作用下分解增强，导致FFA浓度升高，使肌肉对胰岛素敏感水平降低，导致了肌肉和肝脏的IR。由此可见，胰岛素抵抗和炎症因子TNF-α以及细胞因子Leptin关系密切，同时影响脂质代谢，机体细胞因子代谢障碍，则引发一系列内分泌的代谢紊乱。
阳性对照药ROG是噻唑烷二酮类PPAR-γ受体激动剂，可以增强外周组织对胰岛素的敏感性，是治疗IR的有效药物之一，ROG具有增强胰岛素敏感性、降低高血糖、改善脂代谢紊乱、抗动脉粥样硬化的作用[5-7]。该类药物可通过调节Leptin、脂联素、TNF-α的水平及其相关mRNA和蛋白表达量而增强胰岛素敏感性，因此ROG可以作为实验最佳阳性对照药。
研究发现，在细胞水平上，胡椒碱对3T3-L1胰岛素抵抗脂肪细胞具有改善作用，能增加胰岛素抵抗脂肪细胞的糖消耗能力，降低细胞内的FFA[8]。整体动物水平的研究发现，PIP能降低IRS模型大鼠血清FFA水平，以及细胞因子Leptin和TNF-α水平。可见，胡椒碱改善IR、改善脂代谢的作用机制可能与降低炎症因子TNF-α的水平，降低细胞因子Leptin水平，降低脂代谢中TG和FFA水平等诸因素有关。基于此，在证实胡椒碱改善糖代谢紊乱和IR作用的基础上[4]，探索胡椒碱改善脂代谢作用、以及对IR相关靶点细胞因子Leptin、TNF-α、FFA的调节作用，有利于明确PIP改善糖代谢和脂代谢的作用及其相关机制，为PIP相关新药的开发提供实验依据。
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