安息香主产于苏门答腊，是安息香科植物白花树Styrax tonkinensis(Pierre) Craib ex Hart.的干燥树脂，具有开窍醒神、行气活血、止痛之效，用于治疗中风痰厥、气郁暴厥、中恶昏迷、心腹疼痛、产后血晕、小儿惊风[1]。本研究采用线栓法致大鼠永久性局灶性大脑中动脉阻塞的模型(pMCAO)，观察安息香的抗脑缺血损伤作用及其保护机制。
1 材料 1.1 实验动物健康成年♂ SD大鼠，SPF级，体质量230~270 g，购于四川省医学科学院实验动物研究所，合格证号:SCXK (川)2013-15，由成都中医药大学实验动物中心饲养。实验场地：成都中医药大学国家中医药管理局中药药理三级科研实验室(NO:TCM-09-315)。
1.2 实验药物安息香(产地苏门答腊)购于成都新荷花中药材市场，按照2015版《中国药典》安息香项下含量测定要求，测出安息香中苯甲酸含量为38%，符合药典不少于27%的规定。
安息香的给药剂量：按照成人(60 kg)日用量(1.5 g)的40倍计算，即1 g·kg-1。给药前用体积分数为0.05的吐温+质量浓度为2 g·L-1的羧甲基纤维素钠溶液配制成50 g·L-1。配制好的药液置4℃冰箱保存备用。灌胃前将药液加热并摇匀。
1.3 主要仪器与试剂BP211D电子分析天平(赛多利斯)；恒温水浴锅(常州国华电器)；离心机(长沙湘仪)；VEGF ELISA试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司，批号21F057)；TNF-α ELISA试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司，批号21F075)；TTC (Amresco，美国)；尼莫地平(亚宝药业集团股份有限公司，批号150645)。
2 方法 2.1 动物分组及给药大鼠购回经适应性饲养5d后，于d 6取健康♂大鼠65只，按体质量随机分为假手术组、模型对照组、溶剂组(体积分数为0.05的吐温+质量浓度为2 g·L-1的羧甲基纤维素钠)、尼莫地平组(0.012 g·kg-1)、安息香组共5组，每组13只，其中8只用于脑含水量的测定，5只用于脑梗死体积的测定。模型对照组和假手术组均按20 mL·kg-1灌胃给予生理盐水，溶剂组灌胃给予体积分数为0.05的吐温+质量浓度为2 g·L-1的羧甲基纤维素钠(具体给药剂量见表 1)，连续灌胃3 d，每天1次。
| Group | Dose /g·kg-1 |
Neurological score | |
| Ischemia 4 h | Ischemia 24 h | ||
| Sham | - | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
| Model | - | 2.13±0.64▲▲ | 2.27±1.03▲▲ |
| Vehicle | - | 1.67±0.65▲▲ | 1.80±0.63▲▲ |
| Nimodipine | 0.012 | 1.55±0.69 | 1.18±0.75** |
| Benzoinum | 1 | 1.80±0.42 | 1.40±0.84 |
| ▲▲P < 0.01 vs sham; P < 0.05，**P < 0.01 vs model | |||
各组大鼠末次给药30 min后，参照Longa方法[2]加以改进对大鼠进行MCAO手术：大鼠称重，用100 g·L-1水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，仰卧于手术台上，四肢线绳固定。颈部正中切开，依次分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。结扎CCA近心端和ECA远心端。在ICA近端备线，远端放置动脉夹，CCA切口，插入直径为0.28 mm的标记鱼线，松开动脉夹，鱼线向ICA插入20 mm栓线进入ICA，穿过大脑中动脉(MCA)起始端至大脑前动脉(ACA)近端。固定栓线，记录此刻时间，作为大脑局灶性缺血开始的时间。逐层缝合切口，消毒，回笼饲养并观察。动物清醒后爬行时向右转圈(追尾现象)，严重时向右跌倒，提尾时右前肢内收屈曲提示造模成功。假手术组仅作皮肤切开和血管剥离，不做栓线处理，其余操作同其它组。在操作过程中，连续监测动物的体温，并把温度保持在37℃。参照Longa评定法，进行神经功能损伤评分，得分≥1视为造模成功。
2.3 神经功能评分参照Longa评定法，分别于缺血4h、24h后对各组大鼠进行神经功能评分，具体计分方法如下：0分，无任何神经功能缺失体征；1分，未损伤侧前肢不能伸展；2分，向未损伤侧弧线行走或追尾转圈；3分，向未损伤侧倾斜或倾倒；4分，意识障碍，无自主行走。
2.4 脑组织含水量测定各组随机选取8只造模成功大鼠，于缺血24 h后，断头处死，立即取出大脑，表面水分用滤纸吸干后将缺血侧与非缺血侧大脑分别置于称量杯中称其湿重，然后置于105℃-115℃烘箱中烘至恒重后称其干重，根据以下公式计算缺血侧脑组织含水量和脑水肿率：
脑含水量/%=(湿重-干重)/湿重×100%
脑水肿率/%=(缺血侧脑湿重-非缺血侧脑湿重)/非缺血侧脑湿重×100%
2.5 脑组织形态观察及脑梗死率的测定各组选取5只造模成功大鼠，于缺血24 h时断头处死，立即取出大脑，将脑置冰冷的生理盐水(2~3) ℃中10 min，去除嗅球、小脑和低位脑干后，用生理盐水冲洗大脑使表面不留血污，吸干周围水分后，沿脑冠状面切4刀，切成5片。第1刀在脑前极与视交叉连线中间；第2刀在视交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第4刀在漏斗柄与后页尾极之间。然后迅速将脑片置5 mL含有20 g·L-1TTC的磷酸缓冲溶液中，避光温孵30 min，其中每隔5 min翻动1次，经染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而梗死组织呈白色，且界限分明。温孵完毕后将脑片置于40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h后拿出拍照。以分析测量图像软件Imagepro Plus分析脑片面积，分别计算出5个脑片共10个平面的总面积和梗死区域的面积，计算梗死区面积占总面积的比例，即梗死率。
2.6 血清中VEGF及TNF-α含量测定各组大鼠于缺血24 h后麻醉，进行腹主动脉取血，血液静置0.5 h后3 500 r·min-1离心10 min，取上层血清，血清置-20℃冰箱保存备用。按照试剂盒说明书采用ELISA法测定血清VEGF及TNF-α的含量。
2.7 统计学处理所有数据用x±s表示，采用SPSS19.0统计学软件进行处理，其中神经功能评分采用Wilcoxon法秩和检验，其余数据对不同组间进行单因素方差分析。
3 结果 3.1 安息香对MCAO大鼠神经功能损伤的影响与假手术组比较，手术完成后的第4 h、24 h，模型组与溶剂组大鼠均明显呈现出行为障碍(P < 0.01)，说明造模成功。与模型组比较，术后第4 h、24 h，尼莫地平组大鼠的行为评分明显改善(P < 0.05或P < 0.01)；与溶剂组比较，安息香组大鼠的行为评分有改善趋势，但无显著性。见Tab 1。
3.2 安息香对MCAO大鼠缺血侧脑组织含水量及脑水肿率的影响与假手术组比较，模型组与溶剂组的缺血侧脑含水量与脑水肿率均明显升高(P < 0.01)，说明造模成功。而溶剂组脑水肿率明显低于模型组(P < 0.01)；尼莫地平组能明显降低模型大鼠缺血侧脑含水量和脑水肿率(P < 0.01)。与溶剂组比较，安息香组亦能明显降低缺血侧脑含水量和脑水肿率(P < 0.01)。见Tab 2。
| Group | Dose /g·kg-1 |
Ischemic brain tissue water content/% |
Brain edema rate/% |
| Sham | - | 78.66±0.61 | 6.44±1.71 |
| Model | - | 81.90±0.54▲▲ | 20.26±5.13▲▲ |
| Vehicle | - | 81.49±0.67▲▲ | 10.25±3.62▲▲** |
| Nimodipine | 0.012 | 79.13±0.98** | 6.92±2.38** |
| Benzoinum | 1 | 79.64±0.56## | 7.66±1.65## |
| ▲▲P < 0.01 vs sham; **P < 0.01 vs model; ##P < 0.01 vs vehicle | |||
从脑组织形态可以看出，假手术组脑组织结构完整，呈正常的玫瑰红色，未见苍白区。模型组和溶剂组脑组织可见明显的苍白脑梗死区。尼莫地平及安息香均可不同程度改善模型大鼠脑梗死面积。见Fig 1。
|
| Fig 1 TTC-stained brain tissue in each group |
通过梗死区面积与总面积的比值计算得出脑梗死率。结果显示，与假手术组比较，模型组与溶剂组的脑梗死率明显增加(P < 0.01)，说明造模成功。与模型组比较，尼莫地平组的脑梗死率明显降低(P < 0.01)。与溶剂组比较，安息香组亦能明显降低缺血大鼠脑梗死率(P < 0.01)。见Tab 3。
| Group | Dosage/g·kg-1 | Cerebral infarction rate/% | |
| Sham | - | 0.00±0.00 | |
| Model | - | 29.97±4.95▲▲ | |
| Vehicle | - | 28.43±3.51▲▲ | |
| Nimodipine | 0.012 | 7.76±6.04** | |
| Benzoinum | 1 | 13.10±4.14## | |
| ▲▲P < 0.01 vs sham; **P < 0.01 vs model; ##P < 0.01 vs vehicle | |||
与假手术组比较，模型组与溶剂组大鼠血清中VEGF的含量明显降低(P < 0.01)，TNF-α的含量明显升高(P < 0.01)。溶剂组TNF-α的含量明显高于模型组(P < 0.01)；尼莫地平组能明显升高模型大鼠血清中VEGF的含量(P < 0.05)，降低TNF-α的含量(P < 0.01)。与溶剂组比较，安息香组能明显升高大鼠血清中VEGF的含量(P < 0.01)，降低TNF-α的含量(P < 0.05)。见Tab 4。
| Group | Dose/ g·kg-1 |
VEGF/ ng·L-1 |
TNF-α/ ng·L-1 |
| Sham | - | 24.52±2.27 | 41.07±4.26 |
| Model | - | 17.57±3.69▲▲ | 58.20±3.54▲▲ |
| Vehicle | - | 17.23±3.59▲▲ | 78.90±6.50▲▲** |
| Nimodipine | 0.012 | 21.48±1.47 | 45.80±7.63** |
| Benzoinum | 1 | 26.66±6.84## | 65.14±11.80# |
| ▲▲P < 0.01 vs sham; P < 0.05，**P < 0.01 vs model; #P < 0.05，##P < 0.01 vs vehicle | |||
安息香常作为芳香开窍剂的组成药，发挥开窍醒神之功。现代药理研究表明，安息香具有抗炎解热、抗肿瘤、止痛等作用[3]。课题组前期研究也发现安息香具有抗小鼠急性缺氧损伤的作用[4]，能有效保护连二亚硫酸钠造成的PC12细胞缺糖缺氧损伤[5]，能明显延长饱和氯化镁致急性脑缺血小鼠的存活时间[6]，还能开放生理状态下小鼠的血脑屏障[7]。提示安息香对脑缺血损伤可能有一定保护作用，其在改善缺血性脑卒中组方中发挥着较为重要的治疗作用。
脑缺血是导致老年人死亡和残疾的最常见的一种疾病，且随着人口老龄化，其发病率还有增加的趋势[8]。缺血性脑卒中是由多因素、多环节损伤所致的动态复杂的疾病，可分为缺血急性期、恢复期和后遗症时期。脑卒中急性期和恢复期的治疗，直接关系到患者的身体健康和生活质量[9]。脑缺血后，由于缺血、缺氧引起神经细胞变性、坏死、凋亡，导致神经功能受损。尽快恢复缺血区的血液供应，对缺血后神经功能的恢复至关重要。血管生成需要多种因子参与，VEGF是内皮细胞特异性的有丝分裂原，在血管发生和形成过程中起着主要的调控作用，它在血管发生的主要作用包括促进血管内皮细胞增殖、迁移[10]。MCAO动物模型显示，血管新生在缺血1~2周明显可见，在缺血半暗带区最为明显。也有研究表明，MCAO后24h血管内皮细胞开始增生，血管样结构从软脑膜和脑实质的血管向缺血区发展。永久性局灶性脑缺血半暗带区的VEGF表达于缺血后2~14 d内持续增高，新血管的形成始于缺血后6~24 h，并一直持续28 d[11]。
炎症因子引起血管内皮细胞的功能受损是导致动脉粥样硬化的起始环节[12]，炎症反应与脑缺血的发生关系密切，主要涉及脑水肿的发生、血脑屏障的破坏、炎性细胞的浸润、细胞因子和黏附分子的表达等[13]。TNF-α是重要的促炎细胞因子，在脑缺血病理机制中发挥重要作用。TNF-α通常主要由单核巨噬细胞产生，但神经元、神经系统的星形胶质细胞和小胶质细胞受到刺激后也能产生。在发生脑缺血时，TNF-α活性明显升高[14]。
永久性局灶性中动脉栓塞模型是常用的脑缺血动物实验模型，其制作方法经过不断优化，目前已经较为成熟，该方法具有简单、成功率高、重复性好的特点，适用于观察缺血后病理改变及评价相关治疗药物的疗效[15]。
本实验安息香的剂量及溶剂选择均沿袭课题组前期研究结果。用体积分数为0.05的吐温再加质量浓度为2g·L-1的羧甲基纤维素钠才可使安息香得以充分混悬[16]。在本次实验中，溶剂组对个别指标有干预，能明显降低模型大鼠的脑水肿率，升高模型大鼠缺血24 h时血清中TNF-α的含量。但是与溶剂组比较，安息香能明显降低模型大鼠的脑水肿率和模型大鼠血清中TNF-α的含量，提示安息香对MCAO大鼠具有抑制损伤炎性因子TNF-α的作用。
本实验用线栓法制备永久性大脑中动脉阻塞脑缺血大鼠模型(pMCAO)，实验结果显示，安息香能改善模型大鼠神经功能评分、降低缺血侧脑组织含水量、脑水肿率及脑梗死率，具有脑保护作用，可能是发挥开窍醒神效应的生物学基础。本研究还表明：安息香能明显降低模型大鼠血清TNF-α含量，提示其通过抑制炎症级联反应，减轻脑缺血损伤；且安息香能明显升高模型大鼠缺血24 h血清VEGF含量，提示其在加速缺血早期血管内皮细胞增生，启动血管新生方面也可能发挥着重要作用。由此推测，这可能是安息香促进脑缺血模型大鼠神经功能修复的部分机制。而其他相关机制还有待进一步探讨。
( 致谢: 本实验在成都中医药大学国家中医药管理局中药药理三级科研实验室完成，感谢导师王建教授的悉心指导以及陈念、罗世兰、谢倩、马骁等实验室所有同学对本实验的帮助。 )
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