2. 重庆市人民医院中山院区普外科，重庆 400013
2. Dept of General Surgery, People′s Hospital of Chongqing, Chongqing, 400013, China
抑郁症是一种严重危害人类健康的全球性精神障碍疾病，近年来其发病率、致残率和死亡率逐年升高[1]。抑郁症的发病机制复杂，涉及环境、遗传等多方面因素，目前尚未完全阐明。研究显示[2]，单胺递质系统功能紊乱、免疫及炎症系统的激活等多种因素均与抑郁症的发病密切相关，其中单胺递质系统功能紊乱，即“单胺学说”备受关注。该假说认为神经突触间隙的5-羟色胺(serotonin，5-HT)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)以及多巴胺(dopamine, DA)水平低下是导致抑郁发病的重要原因[3]。色氨酸是人体必需氨基酸，是合成单胺递质的重要前体物质。色氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TPH)是脑内生物合成5-HT的限速酶，催化色氨酸生成5-羟色氨酸，然后经多巴脱羧酶脱羧为5-HT。TPH分为TPH1、TPH2两种亚型，其中TPH2对中枢5-HT的合成具有重要意义。TPH表达和/或活性降低均可导致5-HT合成不足，诱发中枢和周围神经系统功能紊乱[4]。多巴脱羧酶(dopa-decarboxylase，DDC)又称色氨酸脱羧酶(tryptophan decarboxylase，AAD)，是L-氨基酸脱羧酶的一种，除了能直接参与合成5-HT外，还可催化L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)脱羧合成DA，间接影响NE的生物合成[5]。临床研究显示，DDC与多种神经精神疾病的发生密切有关，如帕金森综合症、边缘型人格障碍、双相情感障碍、产后抑郁症等，但尚缺乏系统研究[6-8]。单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)是催化单胺类神经递质代谢的主要酶类之一，临床研究发现抑郁症患者MAO-A高表达、各脑区MAO-A含量明显升高[9-10]，提示MAO-A与抑郁症的发生密切相关。
目前，临床常用的抗抑郁药主要作用于突触前膜的单胺递质转运体如5-HT再摄取抑制剂等，但该类药物均存在药物延迟效应，且部分患者无明显疗效。端脑作为高级中枢参与了运动、认知、情绪等调控，海马是边缘系统的重要组成部分，对学习、记忆、行为、情绪等发挥着重要的调节作用，两者均是应激反应的高位调节中枢，与抑郁症发生密切相关。为此，本实验采用孤养结合慢性不可预见刺激(chronically unpredicted stress，CUS)建立大鼠抑郁模型，从大鼠抑郁行为与端脑和海马TPH2、DDC、MAO-A表达的变化来研究单胺递质合成和代谢异常与大鼠抑郁行为的关系，探索药物作用的新靶点。
1 材料与方法 1.1 动物清洁级♂ Sprague-Dawley (SD)大鼠30只，180 g~220 g，重庆医科大学动物实验中心提供，医学动物许可证号：SYXK (渝)2012-2001。
1.2 试剂与仪器蛋白定量BCA试剂盒(碧云天公司)；TPH2、DDC、MAO-A抗体(美国Abcam公司)；PCR引物、TIAN-Script cDNA第一链合成试剂盒、RNA store保存液、TRIzol总RNA提取剂(宝生物工程大连有限公司)；凝胶成像系统、定量PCR仪、WB垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司)；低温高速离心机(德国Sigma公司)。
1.3 方法 1.3.1 分组及建模30只♂ SD大鼠，自由摄食饮水，室温25 ℃左右，在通风良好及正常光照节律条件下适应性喂养1周后，进行开场实验，筛选水平与垂直运动的得分之和在30~120分之间的大鼠为合格大鼠，并随机分为对照组(control group，CG)和模型组(model group，MG)，每组各15只。CG组5只/笼，自由摄食饮水。参照本实验室前期报道的建模方法[11]，采用孤养结合CUS建立实验性大鼠抑郁模型。刺激方式包括夹尾1 min, 禁饮、禁食24 h，水平震荡10 min，昼夜颠倒，通宵照明，45°倾斜鼠笼24 h, 45 ℃热环境5 min，闪频3 h，4 ℃冰水游泳5 min，90分贝噪音3 h，潮湿垫料24 h，共11种刺激，大鼠每日随机接受1种刺激，连续刺激28 d，相同刺激4 d内不连续出现。
1.3.2 开场实验(open-field test，OFT)参照文献[12]并稍作修改，使用100 cm×100 cm×40 cm的木制敞箱，木箱内部漆成黑色，底部均为25个20 cm×20 cm的小方格，在昏暗安静的环境下，将大鼠置于敞箱底部中央，观察在5 min内大鼠的活动情况，记录其水平得分(四肢均进入方格的穿越格数)与垂直得分(直立次数)，将两项得分相加即为开场实验运动得分。
1.3.3 强迫游泳实验(forced-swimming test，FST)参照文献[13]并稍作修改，使用高60 cm、直径20 cm、水深30 cm的透明圆柱形玻璃体，水温保持在25℃左右。在安静环境下，将大鼠放入水中适应2 min后，观察并记录5 min内大鼠的累计不动时间(大鼠在水中保持固定姿势超过2 s则记录为不动时间)。
1.3.4 端脑和海马TPH2、DDC、MAO-A mRNA表达测定造模结束后，每组随机取5只大鼠，用4%水合氯醛麻醉后断头取脑，分离海马和端脑，保存于-80℃。参照Gene Bank大鼠基因序列合成TPH2、DDC、MAO-A和β-actin引物，引物序列及扩增片段见Tab 1。以TRIzol法按试剂盒说明书提取海马和端脑总RNA；取1 μg总RNA按1 μg/20 μL反应体系逆转录合成cDNA，PCR扩增分别采用TPH2、DDC、MAO-A和β-actin引物，扩增条件：95 ℃ 30 s解链、95 ℃ 5 s变性、60 ℃ 30 s退火、72 ℃延伸45 s，循环40次后，72 ℃充分延伸10 min。反应结果以Ct值表示，以2-△△Ct计算目的基因的相对表达量。
| Gene | Primer sequence | Product size/bp |
| TPH2 | Forward：5′-TAAATACTGGGCCAGGAGAGG-3′ | 100 |
| Reverse：5′-GAAGTGTCTTTGCCGCTTCTC-3′ | ||
| DDC | Forward：5′-TCCAGTGTACCCTGACGTGGAG-3′ | 193 |
| Reverse：5′-CGCAAGCATAGCTGGGTAGGA-3′ | ||
| MAO-A | Forward：5′-GCTCGGGAATTTGCGTATC-3′ | 102 |
| Reverse：5′-CCGCCATTGGTAACTGAGAA-3′ | ||
| β-actin | Forward：5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′ | 100 |
| Reverse：5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3′ |
取冻存的海马和端脑剪碎、碾磨、加裂解液处理后提取蛋白，采用BCA试剂盒按说明书定量蛋白浓度。采用Western blot方法检测端脑和海马TPH2、DDC及MAO-A蛋白表达。每孔上样量为40 μg，依次进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入TPH2、DDC、MAO-A一抗4℃孵育过夜、TBST洗膜3次，加入二抗室温封闭30 min后，TBST洗膜3次，ECL显色，凝胶成像系统成像，以β-actin为内参校正DDC、TPH2和MAO-A的蛋白表达。
1.4 统计学分析实验数据以x±s表示，采用Graph Pad Prism 5.0软件进行统计分析，组间比较采用两独立样本t检验。
2 结果 2.1 CUS对大鼠行为的影响开场实验结果显示，与对照组大鼠相比，模型组大鼠开场实验运动得分明显降低(P < 0.01)(Fig 1A)；强迫游泳实验结果显示，与对照组大鼠相比，模型组大鼠强迫游泳不动时间明显延长(P < 0.01)(Fig 1B)。
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| Fig 1 Effect of CUS on rat behaviors in OFT (A) and FST (B)(x±s，n=15) **P < 0.01 vs CG group |
与对照组大鼠相比，模型组大鼠端脑和海马TPH2 mRNA及蛋白表达均明显降低(mRNA表达：端脑P < 0.01，海马P < 0.01；蛋白表达：端脑P < 0.05，海马P < 0.01)(Fig 2)。
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| Fig 2 Effect of CUS on TPH2 mRNA and protein expression in rat brain hippocampus (A) and telencephalon (B)(x±s, n=4) P < 0.05, **P < 0.01 vs CG group |
与对照组大鼠相比，模型组大鼠端脑和海马DDC mRNA及蛋白表达均明显降低(mRNA表达：端脑P < 0.01，海马P < 0.01；蛋白表达：端脑P < 0.05，海马P < 0.05)(Fig 3)。
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| Fig 3 Effect of CUS on DDC mRNA and protein expression in rat brain hippocampus (A) and telencephalon (B)(x±s, n=4) P < 0.05, **P < 0.01 vs CG group |
与对照组大鼠相比，模型组大鼠端脑和海马MAO-A mRNA及蛋白表达均明显升高(mRNA表达：端脑P < 0.01，海马P < 0.01；蛋白表达：端脑P < 0.05，海马P < 0.05)(Fig 4)。
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| Fig 4 Effect of CUS on MAO-A mRNA and protein expression in rat brain hippocampus (A) and telencephalon (B)(x±s, n=4) P < 0.05, **P < 0.01 vs CG group |
抑郁症是一种临床常见的心境障碍性疾病，近年来因其高患病率和自杀率备受关注。CUS抑郁模型模拟社会环境中多变的外源性刺激，诱导大鼠抑郁症的发生，是国内外进行抑郁症发病机制研究的经典的、广泛认可的动物模型之一。OFT通过观察大鼠在新异环境中探究行为的改变评价其焦虑抑郁状态，FST通过观察大鼠在狭小环境中不动时间的变化评价其绝望抑郁状态，两者均是评估大鼠抑郁行为的经典方法[14]。本研究以CUS建立大鼠抑郁模型，采用OFT和FST评价大鼠抑郁行为。结果显示，与对照组大鼠相比，模型组大鼠开场实验探究行为明显减少，运动得分明显降低，强迫游泳实验不动时间明显延长，提示CUS成功诱导大鼠抑郁行为的产生。
脑内单胺递质系统功能紊乱是比较公认的抑郁症发病的生化机制之一。突触间隙的单胺类神经递质如5-HT、NE、DA水平低下、单胺类神经递质受体及转运体表达和/或功能异常等都可能参与抑郁症的发生发展[15]。5-HT是中枢重要的单胺类神经递质之一，调节多种脑功能如情感、睡眠、学习、记忆、摄食等。近年来，新的“5-HT学说”指出，5-羟色胺能神经递质系统功能不足是抑郁症发生的关键因素，也是目前临床药物治疗的靶系统之一[16]。选择性5-HT转运体再摄取抑制剂是临床常用的一类抗抑郁药物，其通过阻断5-HT转运体、提高突触间隙的5-HT水平发挥抗抑郁作用，但此类药物存在明显的延迟效应。因此，进一步研究5-HT通路具有十分重要的意义。5-HT的合成和代谢直接影响脑内5-HT递质水平。TPH是催化色氨酸合成5-HT的限速酶，其中TPH2是脑内合成5-HT的关键亚型。临床研究发现TPH2基因多态性与抑郁症发生密切相关[17-18]，基础研究发现TPH2基因敲除小鼠出现明显的皮层和海马5-HT水平降低及抑郁行为[19]。本研究结果显示，模型组大鼠端脑和海马TPH2 mRNA及蛋白表达下降与抑郁行为的发生密切相关，提示TPH2异常表达参与了抑郁症的发生。
DDC是一种L-氨基酸脱羧酶，可催化5-羟色氨酸转化为5-HT，同时可催化左旋多巴脱羧为DA，DA还可经多巴胺β羟化酶作用转化为NE，继而间接影响NE的生物合成。大量研究已证明5-HT、DA、NE作为脑内重要的单胺类神经递质，均与抑郁症的发生密切相关。因此，DDC功能异常可通过影响脑内5-HT、DA及NE等单胺类递质水平，参与抑郁症的发生。临床研究显示，DDC参与了情感障碍性疾病的发生，其基因多态性与产后焦虑、抑郁行为密切相关[7-8]。目前，对DDC的研究主要集中在肿瘤、帕金森病、阿尔茨海默病等方面，而与抑郁症的关系尚缺乏系统研究。本研究结果显示，模型组大鼠端脑和海马DDC mRNA及蛋白表达均较对照组大鼠明显降低，提示DDC表达下降参与了大鼠抑郁症的发生。
5-HT、DA等单胺类递质降解增多也是抑郁症发生的重要原因之一。MAO是脑内代谢单胺类递质的主要酶类之一，有MAO-A和MAO-B两种亚型。MAO可催化代谢多种单胺类神经递质包括5-HT、DA、NE，最终产生醛类物质和过氧化氢。MAO-A高表达及其胺类代谢产物均与神经精神疾病的发生密切相关。临床研究显示，MAO-A基因多态性与抑郁症发生密切相关[20]。正电子发射断层成像技术检测显示，抑郁症患者各脑区MAO-A含量均明显升高[10]。MAO-A高表达与女性双相情感障碍和重度抑郁症的发生有明显相关性[11]，而MAO抑制剂可有效改善抑郁状态。上述研究均提示MAO功能异常与抑郁症发病相关。本研究结果显示，模型组大鼠端脑和海马MAO-A mRNA及蛋白表达与对照组相比明显升高，提示MAO-A可能通过加速单胺类递质代谢、协同降低递质水平诱导大鼠抑郁症的发生。
综上所述，本研究结果显示单胺递质合成酶TPH2、DDC表达降低，代谢酶MAO-A表达升高与大鼠抑郁症的发生具有相关性，提示抑郁症发生可能与脑内单胺递质合成不足而代谢增多，最终发生递质耗竭密切相关。
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