水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)是视网膜上重要的水通道蛋白之一，参与房水的分泌和排出，有调节眼内水、电解质运输平衡的功能^[1]。褪黑素(melatonin,Mel)是松果体合成分泌的一种吲哚类神经内分泌激素，可以作为黄斑变性、青光眼以及心血管疾病的一种辅助治疗药物，具有降低眼内压(intraocular pressure ,IOP)的作用^[2-3]。然而，褪黑素药物化学合成提取相当困难复杂，且又有半衰期短、个体差异大等不足。以色列研制出的Neu-P11，是能够克服以上缺陷的新型褪黑素非选择性受体激动剂，具有抗抑郁、抗氧化和镇痛等作用，对糖尿病和高血压等疾病有一定治疗效果^[4-5]，能降低正常新西兰大白兔眼内压^[6]。本文旨在研究Neu-P11对AQP4表达和高眼压状态下IOP的影响。

1 材料与方法 1.1 动物与材料

健康SD大鼠30只( 购自南华大学动物部，体质量为200~250 g)。Mel/Neu-P11(Neurim Pharmaceuticals Ltd)； AQP4一抗(Cell Signaling Technology)。

1.2 高眼压模型建立

采用Trendelenburg卧位 (头低脚高80°位置)诱导急性高眼压大鼠模型。每天8 ∶00~9 ∶00 am，动物被置于Trendelenburg卧位并监测眼压(测量20 min内IOP，每 5 min测1次，共4次，取最大值)。眼角膜滴注固定体积(10 μL)药物Mel/Neu-P11(100 μmol·L^-1)局部治疗，对侧眼滴注相同体积生理盐水进行自身对照。给药后，水平位置休息2 h，再次放置于Trendelenburg,卧位45 min后,置于平面，手持Tonopen XL眼压计垂直于被测动物眼球连续测量6 h眼内压，重复实验1周。

1.3 视网膜组织形态学检查

过量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠后，迅速摘除整个实验眼并标记，立即放入眼球固定液(Carrnov25改良液)中固定24~36 h，脱水-透明-包埋-切片-烤干,常规HE染色。

1.4 免疫组化染色检测视网膜中AQP4的表达

参照SP-9001工作方法，孵一至三抗，DAB显色30~60 s后，用PBS终止显色，苏木精复染，盐酸分色，常规梯度乙醇脱水，中性树胶封片。

1.5 统计学分析

对所有数据结果采用SPSS18.0软件进行统计分析，多组均数比较釆用One-way ANOVA，LSD检验进行多个均数之间的两两比较。

2 结果

与正常对照组相比，Trendelenburg卧位处理后，模型组IOP上升了2.03倍(P<0.01)，建模成功。局部滴注Neu-P11/Mel治疗1周的结果发现，在3~6 h时降低IOP效果较好，尤其是在3 h，且在治疗的d 4有最佳疗效。通过比较眼内压均值结果显示，与模型组相比，Neu-P11/Mel治疗组IOP均有所降低(P<0.05)。高眼压模型组视网膜增厚水肿，胞质空亮，层次清晰欠佳，内层视网膜细胞间隙增大变厚，AQP4蛋白高表达。药物Neu-P11/ Mel治疗后，视网膜水肿等各方面得到了不同程度的改善，AQP4的阳性表达减弱。

3 讨论

MT1、MT2和MT3是褪黑素主要的3类受体。MT1可抑制促心血管收缩相关激素分泌，MT2能调节昼夜节律和视网膜多巴胺的释放，MT3可调节机体炎症反应和眼内压。褪黑素调节眼压平衡与其受体MT2和MT3相关^[3]。Neu-P11为褪黑素非选择性受体激动剂，与褪黑素有类似功能。本研究采用Trendelenburg卧位(头低脚高80°位置)法成功建立急性高眼压大鼠模型，结果模型组IOP升高为正常组的3倍以上，视网膜明显增厚水肿，神经节细胞排列混乱，各层AQP4高表达，呈强阳性。Neu-P11/Mel能明显逆转这一现象。提示，褪黑素及其受体激动剂Neu-P11能通过降低AQP4在视网膜的表达，调节眼内水和电解质的平衡，保护视网膜结构和功能的完整性，降低眼内压。

( 致谢: 本实验在南华大学药学与生物科学学院生物化学与分子生物学实验室、南华大学心血管疾病研究所以及南华大学动物部完成。在此，对各位老师和同学的指导和帮助表示诚挚的谢意。 )