2. 广西食品药品监督管理局，广西 南宁 530022;
3. 广西中医药大学药学院，广西 南宁 530001;
4. 暨南大学药学院中药及天然药物研究所，广东 广州 510632;
5. 广西医科大学第一附属医院临床药学部，广西 南宁 530021
2. Guangxi Food and Drug Administration, Nanning 530022, China ;
3. Pharmacy College, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001,China ;
4. Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products, Jinan University, Guangzhou 510632,China ;
5. Dept of Clinical Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021,China
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重影响着人类的生命健康。在我国的癌症统计数据中，肺癌的发病率和死亡率均位居第一位，是癌症死亡的主要原因。在新增癌症患者中，肺癌的发病率逐年上升。据估计，2015年我国肺癌患者新增病例数将会达到73.33万人，死亡人数达到61.02万人[1]。Topo Ⅱ对于真核细胞的存活起着重要的作用，其在DNA的复制、转录、重组过程中，以及在形成正确的染色体结构、染色体分离和浓缩中发挥着重要的作用[2]，是抗肿瘤药物的重要靶标。Topo Ⅱ抑制剂按抑制机制可以分为催化抑制剂和毒剂，Topo Ⅱ催化抑制剂作用于Topo Ⅱ催化反应的各个不同阶段，抑制Topo Ⅱ的催化活性；而Topo Ⅱ毒剂能够捕获并稳定Topo Ⅱ催化过程的中间产物——可切割复合物，造成DNA双链断裂[3]。例如，阿克拉霉素和依托泊苷作为Topo Ⅱ抑制剂应用于临床，但阿克拉霉素心脏毒性大，依托泊苷骨髓抑制作用较明显。因此，寻找新型高效低毒的Topo Ⅱ抑制剂是目前迫切需要解决的问题。
从天然植物中提取化合物进行筛选和发掘，是开发高效低毒抗癌药物的重要途径。如从罗汉果分离出的罗汉果醇被证明具有诱导肺癌细胞A549 凋亡的作用[4]。二去水卫矛醇(1,2:5,6-dianhydrogaIactitol,DAG)也是一种新型的植物生物碱类抗肿瘤药，属己糖醇类化合物，其化学名称为1,2,5,6-二脱水半乳糖醇。DAG是主产于广西的卫矛科植物蜜花美登木(Meytenus confertiflotus)中分离出的卫矛醇(dulcitol)为原料[5]，经溴化、消除反应而制得的1,6-二溴卫矛醇的双环氧化产物。其具有易溶于水，抗肿瘤活性高等优点[6]。DAG目前已应用于临床，主要用于慢性粒细胞性白血病的治疗[7]。DAG对恶性胶质瘤也有疗效，目前已进入Ⅱ期临床研究[8]。此外，DAG还对复发性脑瘤、胃癌、肝癌、鼻咽癌等均有抑制作用[9-10]。值得注意的是，DAG在临床上也应用于肺癌的治疗，且疗效明显[11]。然而，DAG抗肺癌作用机制尚不清楚。据研究报道，DAG抗肿瘤的主要机制是直接结合到DNA或RNA上，从而影响DNA的复制和转录[12]。然而，国内外关于DAG与Topo Ⅱ相互作用的机制尚未报道。为此，本研究将探讨DAG对肺癌细胞DNA Topo Ⅱ表达的影响，为DAG的临床应用提供新的科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 药物与试剂DAG由广西梧州制药(集团)股份有限公司提供；依托泊苷(VP16)为齐鲁制药有限公司产品；RPMI 1640培养基为美国Hyclone公司产品；胎牛血清为浙江天杭生物科技股份有限公司产品；青霉素-链霉素为北京索莱宝科技有限公司产品；0.25%胰蛋白酶为美国Thermo Fisher公司产品；CCK-8为上海尚宝生物科技有限公司产品；Hoechst 33342为南京凯基生物科技发展有限公司产品；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒均为日本TaKaRa公司产品；Topo Ⅱα和Topo Ⅱβ抗体为美国Abcam公司产品；β-actin抗体和二抗均为美国CST公司产品。
1.1.2 细胞培养人肺癌细胞NCI-H460购自中科院上海细胞库。细胞接种在25 cm2培养瓶中，所用培养基含有RPMI 1640培养基、10%(V/V)胎牛血清与1%(V/V)青霉素-链霉素，在37℃、5%(V/V)CO2培养箱中培养。
1.1.3 仪器CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)；酶标仪(香港分子仪器公司)；荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司) ；蛋白免疫印记系统(美国Bio-Rad公司)。
1.2 方法 1.2.1 CCK-8实验方法取处于对数生长期的细胞，接种于96孔培养板，每孔加入5.0×103个细胞。设空白组、对照组和不同浓度的给药组，待细胞贴壁，加入不同浓度的药物。药物作用48 h后吸出培养基，每孔加入CCK-8 10 μL，在培养箱中孵育1.5 h，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，计算细胞存活率。同时，以依托泊苷做为阳性对照。使用Graphpad软件计算半数抑制浓度(IC50)。
1.2.2 集落形成实验取处于对数生长期的细胞，接种于6孔培养板，每孔加入300个细胞。设空白对照组和不同浓度的给药组，待细胞贴壁，加入不同浓度的药物。同时，以依托泊苷做为阳性对照。药物作用24 h后吸出培养基，同时加入5 mL新鲜培养基，培养7 d后吸出培养基，用甲醇在-20℃条件下固定细胞30 min，加入结晶紫染色15 min，PBS清洗2次后，记录每孔细胞团的数目。
1.2.3 细胞形态学观察取处于对数生长期的细胞，接种于6孔培养板，每孔加入3.0×105个细胞。设空白对照组和不同浓度的给药组，24 h后，加入不同浓度的药物。药物作用24 h后吸出培养液，PBS清洗2次。在倒置显微镜下观察细胞的形态，并随机拍照。
1.2.4 Hoechst 33342染色取处于对数生长期的细胞，接种于6孔培养板，每孔加入3.0×105个细胞。设空白对照组和不同浓度的给药组，细胞贴壁后，加入不同浓度的药物。药物作用48 h后吸出培养基，用PBS清洗1次，每孔加入PBS(含1 g·L-1 Hoechst 33342)，在37℃培养箱中避光孵育10 min。用PBS清洗2次，在激发波长350 nm，发射波长460 nm的荧光显微镜下随机拍照。
1.2.5 Western blot取处于对数生长的细胞，接种于6孔培养板，每孔加入3.0×105个细胞。培养24 h后，设置空白对照组和不同浓度的给药组，作用48 h。收集各组细胞，采用RIPA裂解液裂解细胞后，离心收集上清。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，按每孔30 μg蛋白电泳分离，然后将蛋白转到PVDF膜上，5%(W/W)牛奶封闭后敷上Topo Ⅱα和Topo Ⅱβ抗体，以β-actin作为内参。孵完一抗后，室温下孵育二抗1 h，接着用ECL显影液曝光显影。蛋白条带应用Image J软件进行光密度值定量分析。
1.2.6 Real time PCR检测Topo Ⅱ在肺癌NCI-H460细胞的表达取处于对数生长期的细胞，接种于25 cm2培养瓶，每瓶加入1.0×106个细胞。设空白对照组和不同浓度的给药组，待细胞贴壁，加入不同浓度的药物。药物作用48 h后，按照TRIzol裂解液说明书提取细胞总RNA。取2 μg RNA做逆转录模板，按照说明书合成cDNA。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。Topo Ⅱα上游序列：5′-TTGCAGCCCATTGGTCAGTT-3′，下游序列：5′-AGGACCACCCAGTACCGATT-3′。Topo Ⅱβ上游序列：5′-GTGCTGAGGGCATTGGTACT-3′，下游序列：5′-AGCAGCTTCTGCTTGTGCTA-3′。β-actin上游序列：5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGCC-3′,下游序列：5′-GCGTACAGGGATAGCACAGC-3′。 Real time PCR反应体系为20 μL。应用SYBR Green试剂盒，在ABI7300 Real time PCR 系统中进行。
1.2.7 模拟分子对接为了研究DAG与TOP Ⅱ的分子对接方式，我们运用了Sybyl 8.0软件(Tripos Inc.)中的Surflex-dock模块。人Topo Ⅱα ATPase(PDB code: 1ZXM)的晶体结构和Topo Ⅱβ(PDB code:3QX3)的晶体结构是从蛋白数据Protein Data Bank(PDB)中获得[13-14]。DAG、沙尔威辛和依托泊苷3D结构的确定是根据其平面化学结构和手性，并对其进行能量最小化。采用自动搜索模式，将沙尔威辛对接进入Topo Ⅱα，依托泊苷对接进入Topo Ⅱβ。利用分数最高的结合模式做为最优结合。按上述对接方法，将DAG对接入Topo Ⅱ结构，以研究其与Topo Ⅱ的结合位点。
1.2.8 统计学方法所有数据均以x±s表示，采用Graphpad Prism 5.0软件分析数据，并采用t检验对组间进行统计学分析。
2 结果 2.1 DAG对NCI-H460细胞增殖活力的影响CCK-8细胞活力检测结果显示，经不同浓度DAG作用48 h后，NCI-H460细胞的OD值与对照组相比呈下降趋势，且具有明显浓度依赖性关系，其IC50为(9.68±1.02) mg·L-1，而阳性对照依托泊苷的IC50为(5.19±0.53) mg·L-1。提示DAG具有明显的体外抗肺癌活性，但其活性稍弱于依托泊苷。见Fig 1。
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| Fig 1 Cell viability of NCI-H460 cells treated with DAG and VP16 respectively *P<0.05,**P<0.01 vs control |
细胞克隆形成实验结果表明，DAG在处理24 h后撤除药物继续培养，依然能明显地抑制NCI-H460细胞克隆团的形成，并呈剂量依赖性，与阳性药依托泊苷效果类似。上述结果表明DAG能持续抑制NCI-H460细胞的增殖。见Fig 2。
2.3 DAG对NCI-H460细胞形态的影响在倒置显微镜下观察，各给药组细胞均不同程度出现细胞变圆缩小、贴壁能力减弱、胞质内颗粒边缘化，甚至细胞破碎等损伤现象，随着浓度的增加，细胞数量明显减少，而空白组细胞生长良好，细胞形态完整。见Fig 3。
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| Fig 2 The colony numbers of NCI-H460 cells treated with DAG and VP16 respectively **P<0.01 vs control |
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| Fig 3 Morphological changes of NCI-H460 cells treated with DAG(×200) A: Control group; B: DAG 2.5 mg·L-1; C: DAG 5.0 mg·L-1; D: DAG 10.0 mg·L-1. Scale bar: 50 μm |
Hoechst 33342是一种可以穿过细胞膜与染色质结合的蓝色荧光染料。细胞染色后通过荧光显微镜观察，结果显示正常未给药组细胞内荧光较弱，细胞核形态正常，DAG作用48 h后细胞内荧光强度随DAG浓度的提高明显增强，并出现胞核形态异常，凝缩现象，提示DAG对NCI-H460细胞的DNA具有损伤作用。见Fig 4。
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| Fig 4 Morphological changes of nucleus induced by DAG in NCI-H460 cells (×200，stained with Hoechst 33342) A: Control group; B: DAG 2.5 mg·L-1; C: DAG 5.0 mg·L-1; D: DAG 10.0 mg·L-1. Scale bar: 50 μm |
Topo Ⅱ在DNA的复制、转录、重组过程中具有重要作用，当Topo Ⅱ受到抑制时，可以导致DNA双链断裂。为此，我们检测了DAG对Topo Ⅱ mRNA的影响。结果表明，与空白对照组相比，不同浓度的DAG能明显抑制Topo Ⅱα mRNA的表达。同样，DAG也能抑制Topo Ⅱβ mRNA的表达，与空白组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。以上研究结果表明DAG对Topo Ⅱ的不同亚型的表达均具有明显的抑制作用。见Fig 5。
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| Fig 5 Effects of DAG on mRNA expression of TopoⅡα,TopoⅡβ in NCI-H460 cells **P<0.01 vs control |
Topo Ⅱ mRNA的表达水平直接与蛋白表达水平有关。为了验证Topo Ⅱ mRNA受到抑制后蛋白表达水平是否也随之降低，我们进一步检测了Topo Ⅱα和Topo Ⅱβ蛋白表达水平。Fig 6结果表明，不同浓度的DAG均能明显降低Topo Ⅱα的表达水平。另外，DAG在5 mg·L-1和10 mg·L-1两个浓度下能明显抑制Topo Ⅱβ的表达，与mRNA的表达水平具有一定的一致性。以上研究结果提示DAG可抑制TopoⅡα和TopoⅡβ的蛋白表达。
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| Fig 6 Effects of DAG on protein expression of TopoⅡα,TopoⅡβ in NCI-H460 cells *P<0.05,**P<0.01 vs control |
为了进一步研究DAG对Topo Ⅱ的影响，采用计算机分子模拟对接方法探讨DAG与Topo Ⅱ是否具有相互作用，以及其作用方式和结合位点。对接模型结果显示，DAG与Topo Ⅱα之间形成了3个氢键，DAG的三元环中的氧原子与Topo Ⅱα 在120和121 2个色氨酸的残基形成具有相互作用的氢键，3-C上的羟基与140位上的赖氨酸残基也形成1个氢键。与阳性药沙尔威辛相比，140位上的赖氨酸残基同样被沙尔威辛占据，显示DAG结合位点与沙尔威辛部分重合。DAG的1,2-环氧及3-C上的羟基与Topo Ⅱβ在52位上的精氨酸残基形成2个氢键，此外，3-C上的羟基与1375位的氨基酸形成共轭与单原子相互作用，而这些位点同样被依托泊苷占据，显示DAG与Topo Ⅱβ 的结合占据依托泊苷与TopoⅡβ的结合位点。综上所述，计算机分子模拟对接结果显示，DAG与TopoⅡ的结合位点与沙尔威辛、依托泊苷部分重叠。如Fig 7所示。
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| Fig 7 Molecular docking of DAG with TopoⅡα and TopoⅡβ A: The docking prediction of DAG bound to the TopoⅡα; B: The docking prediction of salvicine bound to the TopoⅡα; C: The docking prediction of DAG bound to the TopoⅡβ; D: The docking prediction of etoposide bound to the TopoⅡβ. |
TopoⅡ在生物界普遍存在，是细胞内一种重要的核酶，为生长所必需。TopoⅡ分为α和β 2个亚型，可催化DNA 拓扑异构化即超螺旋状态和解螺旋状态相互的转换反应，其功能由ATP提供能量，Mg2+也是必须的。TopoⅡ能识别特殊的DNA序列，并将双链DNA选择性切断[15]。在许多肿瘤细胞中，TopoⅡ的含量及活性远远高于正常组织的细胞，因此，TopoⅡ已成为抗肿瘤药物研究中的重要靶点。TopoⅡ抑制剂可分为TopoⅡα抑制剂和TopoⅡβ抑制剂，目前这2种抑制剂的作用区别尚未清楚。TopoⅡ抑制剂通过影响TopoⅡ作用过程的各个阶段来影响双链DNA的断裂和再连接反应。它可以作用于DNA，也可以作用于拓扑异构酶，还可以作用于TopoⅡ-DNA可切割复合物，影响DNA复制过程，导致细胞凋亡[16]。
DAG对肺癌NCI-H460细胞的研究中，经不同浓度处理48 h后，CCK-8细胞活力检测实验、细胞克隆形成实验均表明DAG对肺癌NCI-H460细胞有明显的抑制作用，且具有明显的浓度依赖关系，其活性与阳性药依托泊苷接近，说明DAG抗肿瘤活性明显。DAG在15 mg·L-1浓度下可抑制大部分肿瘤细胞的增殖，提示该浓度是DAG较为合适的治疗窗。Hoechst 33342实验中发现NCI-H460细胞胞核出现明显的破碎现象，提示DAG可引起DNA损伤，可能引起细胞凋亡。进一步机制研究发现，DAG能明显降低TopoⅡα、TopoⅡβ mRNA水平，并且随着DAG浓度的增加，抑制作用逐步增加。与此相对应的是，DAG也能抑制细胞内TopoⅡα和TopoⅡβ的蛋白表达。为了更进一步探讨DAG与TopoⅡ之间是否具有直接的结合作用，通过分析人TopoⅡα ATPase晶体结构及TopoⅡβ的晶体结构，发现DAG主要通过极性的氢键结合到TopoⅡ上，且与阳性药结合位点有部分重叠，说明其与阳性药的结合区域相似，可能会导致TopoⅡ活性受到抑制。Levin等[12]以14C标记DAG对3种鼠类脑肿瘤的活性进行研究，发现DAG均可与RNA和DNA结合，且与RNA的结合能力为DNA的6倍。因此，DAG可能是通过与TopoⅡ mRNA结合，从而影响TopoⅡ蛋白的合成，进而引起细胞内DNA的断裂，最终导致细胞死亡。另一方面，DAG也有可能和TopoⅡ直接结合，影响TopoⅡ的活性，从而导致DNA复制和转录过程受到影响，进而影响TopoⅡ mRNA的转录水平，但是DAG的具体作用机制尚待进一步研究。
( 致谢: 本文实验在广西医科大学药学院公共实验平台完成，对参与实验的人员表示感谢！ )
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