老鼠簕(Acanthus ilicifolius L.)是爵床科老鼠簕属的植物，为重要药用红树林植物，我国民间主要用于治疗急慢性肝炎、淋巴结肿胀、肝脾肿大、胃痛、咳嗽、哮喘等[1]。本课题组前期研究表明，老鼠簕药理活性成分主要为老鼠簕生物碱，具有保肝作用[2]。其中，老鼠簕生物碱A[4-羟基苯并噁唑-2-酮，英文名4-hydroxy-2(3H)-benzoxazolone，简称HBOA]是老鼠簕生物碱中的1个活性单体。
肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是肝硬化发生的前奏和必经的中间环节，是慢性肝病的重要病理特征，也是临床治疗慢性肝病的关键环节。研究证实，慢性炎症反应是肝纤维化发生、发展的重要因素[3]。近年来，人们对细胞因子在炎症反应中的作用有了较深入的研究，高迁移率族蛋白 B1（high mobility group box 1，HMGB1）是一种晚期致炎因子，可能参与了多种组织器官如肺、肝的纤维化进程[4]。由于其具有作用持久的特点，针对HMGB1的治疗比其他早期炎症因子具有更宽泛的治疗窗口期。所以，以HMGB1为靶点的抗炎治疗引起人们的极大兴趣[5]。本实验拟通过CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型，检测大鼠血清及肝组织中HMGB1的含量，观察大鼠肝组织病理学及血清肝功能指标、早期炎症因子的变化，并探索其中的内在联系，初步探讨老鼠簕生物碱A基于HMGB1 抗肝纤维化的作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 受试药物与试剂HBOA 由广西医科大学药学院药物化学教研室合成，纯度为0.9937；秋水仙碱购于西双版纳药业有限责任公司（批号：140515）；CCl4、羧甲基纤维素钠购于西陇化工股份有限公司；ALT、AST及T-BIL试剂盒购于南京建成生物工程研究所；大鼠HMGB1、IL-1β及TNF-α ELISA 试剂盒、HMGB1兔多克隆抗体、兔IgG-免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司；引物、RNAiso Plus、Prime Script RT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ购于日本TaKaRa公司。
1.1.2 仪器TGL-16G-A高速冷冻离心机（上海安享科学仪器厂）；电热恒温水浴箱（北京塞多利斯仪器系统有限公司）；ND-2010 型紫外可见分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific）；连续光谱扫描式酶标仪（香港分子仪器公司）；CX-41型倒置显微镜（日本Olympus公司）；ABI7300实时荧光定量PCR仪（应用生物系统公司）。
1.1.3 动物SD大鼠，60只，♂，180 g~220 g，由广西医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK桂 2015-0002，实验单位使用许可证编号：SYXK桂 2011-0005）。于室温（23±2）℃、湿度（60±20）%、标准光线环境下饲以我校实验动物中心提供的专业饲料，饲养期间大鼠均自由摄食、饮水。
1.2 方法 1.2.1 动物分组与干预60只SD大鼠适应饲养1周后，其中50只大鼠灌胃予以体积分数为0.40的CCl4橄榄油溶液3 mL·kg-1建立肝纤维化模型，首剂加倍，每周2次，共12周。剩余10只大鼠设为正常对照组，仅灌胃相应体积生理盐水。第8周，取10只模型对照组大鼠HE 染色病理检测结果证实大鼠肝纤维化模型成立后，将大鼠随机分为模型对照组（MC）、秋水仙碱组（Colchicine）、HBOA 高剂量组（HH）、HBOA 低剂量组（HL），每组各10只，以及正常对照组（NC）10只。从第9周开始，秋水仙碱组灌胃给予秋水仙碱混悬液（0.4 mg·kg-1）；HBOA高剂量组（100 mg·kg-1）、HBOA 低剂量组（50 mg·kg-1）灌胃予以质量浓度为6 g·L-1的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成的HBOA混悬液（溶液现配现用）；模型对照组及正常对照组灌胃给予相应体积CMC-Na 溶液10 mL·kg-1，连续4周。
1.2.2 取材12周后，大鼠用10%的水合氯醛麻醉，腹主动脉抽血，经3 000 r·min-1离心10 min后，分离血清于-80 ℃保存备用。同时取相同部位肝左叶约1 cm×1 cm 大小，用10%的福尔马林固定，石蜡包埋切片，病理切片行常规HE及Masson染色，光镜下观察肝组织病理变化。将部分肝组织用4%的多聚甲醛保存，用于制作免疫组化切片，其余肝脏置于-80 ℃冰箱备用。
1.2.3 血清观察指标肝功能指标 ALT、AST、T-BIL严格根据试剂盒说明书指示方法检测。酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中HMGB1、IL-1β、TNF-α 的水平。
1.2.4 大鼠肝组织中HMGB1蛋白及mRNA表达分析采用免疫组化SP法测定肝组织中HMGB1蛋白的表达，脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、封闭、滴加一抗及二抗、染色均严格按照说明书步骤操作。采用自来水浸泡10 min返蓝后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。采用Image-Pro Plus软件分析免疫组化图片光密度（IOD）值。
根据Genbank大鼠HMGB1、GAPDH引物序列设计HMGB1及GAPDH的上、下游引物（Tab 1）。严格根据RNAiso Plus 试剂盒说明书提取大鼠肝脏总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度，A260/280均为1.8~2.0，纯度符合要求。通过RNA 20 μL逆转录体系，在37 ℃15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃条件下逆转录得到cDNA。实时荧光定量PCR 采用两步法：95℃ 30 s预变性；95 ℃ 5 s变性、60 ℃ 31 s退火，共40个循环进行cDNA扩增。
| Gene | Sequences | |
| HMGB1 | Forward | 5′-CGAATGTGTCTTTAGCTAGCCCTGT-3′ |
| Reverse | 5′-CAGACTGTACCAGGCAAGGTTAGTG-3′ | |
| GAPDH | Forward | 5′-GTATGACTCTACCCACGGCAAGT-3′ |
| Reverse | 5′-TTCCCGTTGATGACCAGCTT-3′ |
采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。结果以x±s表示，采用单因素方差分析(One-way ANOVA) 对各项指标进行组间比较，组间差异用LSD检验。
2 结果 2.1 肝组织病理学变化HE染色结果可见,正常对照组肝小叶的结构完整，肝细胞排列整齐，肝索结构清晰，无炎症细胞浸润（Fig 1A）；模型对照组可见肝小叶被破坏，肝细胞结节、脂肪变性、气球样变性及坏死，炎症细胞浸润，肝索排列紊乱，伴肝纤维化(Fig 1B)；秋水仙碱组及HBOA高、低剂量组对纤维组织增生情况均有明显的改善，肝组织肝小叶结构已恢复至正常，肝细胞变性、坏死及炎性细胞浸润程度也明显减少(Fig 1C、Fig 1D、Fig 1E)。Masson染色结果显示，正常对照组大鼠肝细胞完整，仅于汇管区及中央静脉有少量胶原纤维存在,无纤维组织增生（Fig 2A）; 模型对照组大鼠肝组织中大量胶原纤维增生，汇管区呈明显的桥样纤维化，并向肝小叶内延伸，形成较粗大的纤维间隔(Fig 2B)；秋水仙碱组及 HBOA 高、低剂量组大鼠肝组织中胶原纤维增生较模型对照组明显减少，仅分布于汇管区及血管周围，且纤维间隔薄，不完全分割肝小叶，其中HBOA 高剂量组肝组织结构趋向正常(Fig 2C、2D、2E)。 各组大鼠肝纤维化程度按Ishak 评分系统分期及计分。分期结果显示，模型对照组主要分布在F4-F5期，秋水仙碱组主要分布在F2-F3期，HBOA高剂量组分布在F0-F1期，HBOA低剂量组主要分布在F2-F4期（Tab 2）。
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| Fig 1 Rat liver histopathological changes observed by HE staining in different groups(×100) A: NC; B:MC; C:Colchicine; D:HH; E:HL |
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| Fig 2 hanges of rat liver tissue collagen observed by Masson staining in different groups(×100) A:NC; B:MC; C:Colchicine; D:HH; E:HL |
| Group | Dose/mg·kg-1 | n | Stage of liver fibrosis | Score of liver fibrosis（x±s） | ||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||||
| Normal | - | 10 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1.10±1.52 |
| Model | - | 8 | 0 | 0 | 0 | 1 | 3 | 3 | 1 | 13.25±3.24** |
| Colchicine | 0.4 | 9 | 0 | 1 | 3 | 3 | 1 | 1 | 0 | 8.11±3.44## |
| HBOA | 100 | 10 | 4 | 3 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 4.80±4.05## |
| 50 | 8 | 0 | 1 | 3 | 2 | 2 | 0 | 0 | 8.13±3.52## | |
| **P<0.01 vs normal;##P<0.01 vs model | ||||||||||
与正常对照组比较，模型对照组血清中的AST、ALT 及T-BIL含量明显升高（P<0.01）；与模型对照组比较，HBOA 高剂量组可降低血清中的AST、ALT 及T-BIL 水平（P<0.01）（Fig 3）。
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| Fig 3 Effects of HBOA on serum AST,ALT and T-BIL in CCl4-induced liver fibrosis rats A: AST; B: ALT; C: T-BIL.**P<0.01 vs normal control;##P<0.01 vs model control |
由ELISA结果可见，与正常对照组比较，模型对照组血清中的HMGB1、IL-1β及TNF-α含量明显升高（P<0.01）；与模型对照组比较，HBOA高剂量组明显降低血清中的HMGB1、IL-1β及TNF-α水平（P<0.01）（Fig 4）。
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| Fig 4 Effects of HBOA on serum HMGB1,IL-1β and TNF-α in CCl4-induced liver fibrosis rats A:HMGB1 protein; B: HMGB1 mRNA.**P<0.01 vs normal control;##P<0.01 vs model control |
免疫组化法结果可见(Fig 5A)，与正常对照组比较，模型对照组肝组织中的HMGB1 含量明显升高（P<0.01）；与模型对照组比较，HBOA高、低剂量组均明显降低肝组织中的HMGB1水平（P<0.01）。同时，实时荧光定量PCR结果可见(Fig 5B)，与正常对照组比较，模型对照组肝组织中HMGB1 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）；与模型对照组比较，HBOA高、低剂量组均明显降低肝组织中的HMGB1 mRNA表达水平（P<0.01）。
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| Fig 5 Effect of HBOA on tissue expression of HMGB1protein and mRNA in CCl4-induced liver fibrosis rats A:HMGB1;B:IL-1β;C:TNF-α.**P<0.01 vs normal control;##P<0.01 vs model control |
大鼠血清中HMGB1含量分别与肝功能指标水平及与早期炎症因子水平的变化趋势相同（Fig 6）。进一步分别作HMGB1 与肝功能指标及与早期炎症因子的直线相关与回归分析，发现HMGB1 与肝功能指标AST、ALT及T-BIL 呈正相关，RAST2=0.90、RALT2=0.91、RT-BIL2=0.74；HMGB1与早期炎症因子IL-1β及TNF-α呈正相关，RIL-1β2=0.99、RTNF-α2=0.97,拟合度良好。
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| Fig 6 Relation between serum HMGB1level and liver function，inflammatory cytokines A: The relation of HMGB1 to liver function index; B: The relation of HMGB1 to IL-1β and TNF-α |
肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）是肝纤维化的关键细胞，在肝纤维化的发生、发展过程中发挥核心作用，其活化调控被视为抗肝纤维化的治疗靶标[6]。当肝脏受到各种急、慢性炎症刺激后，可激活HSCs，使其变为肌成纤维细胞，最终合成及分泌大量的细胞外基质（ECM）沉积于肝脏内，启动肝纤维化的病理过程[7]。可见，慢性炎症反应是肝纤维化发生、发展的重要因素。
炎症因子HMGB1是一种高度保守的染色体相关蛋白，具有出现晚、作用持久的特点。在正常情况下，HMGB1在细胞核内不参与炎症反应。然而，当机体受到刺激而产生反应时，HMGB1不仅可由激活的巨噬细胞、成熟的树突细胞（mDC）及自然杀伤（NK）细胞主动分泌，还可由坏死细胞被动释放至细胞外，在胞外作为损伤相关分子模式（DAMPs）成员之一，具有强大的致炎细胞因子活性，在细胞外参与多种病理过程[8]。在肝纤维化的发生、发展中，HMGB1作为晚期炎症介质，成为慢性炎症持续存在并持久激活HSCs的基础。HMGB1可通过晚期糖基化受体（RAGE）及 Toll 样受体（TLRs）启动和增强多个通路[9-10]，如 TLR4-MyD88-NF-κB 通路，激活内皮细胞，促使其产生炎症细胞因子如IL-1β、TNF-α 等，而产生的IL-1β、TNF-α 又可与HMGB1相互刺激、促进，致使HMGB1 大量释放，最终形成一个完整的回路，引起瀑布样的级联反应，造成炎症反应的失控迁延，增强肝脏损伤和炎症[11]。Bai等[12]发现，抑制HMGB1 能降低IL-1β、TNF-α 的表达，减轻肝脏炎性反应，减轻肝纤维化程度。然而，仅给予早期炎症因子例如IL-1β、TNF-α 的拮抗剂，并不能阻止肝纤维化病情进展[13]。所以，考虑是否是HMGB1的大量释放，导致HSCs持续激活，致使ECM 堆积，导致肝纤维化的发生。
本实验研究结果显示，受试药物HBOA可改善肝纤维化大鼠的血清肝功能指标，有效降低血液中炎症因子HMGB1、IL-1β、TNF-α 的含量，下调肝组织中HMGB1蛋白及HMGB1 mRNA的表达，明显减轻大鼠肝纤维化程度，HBOA高剂量组保肝作用尤为明显。而且，HMGB1与血清中肝功能指标拟合度良好（rAST2=0.90、rALT2=0.91、rT-BIL2=0.74），表明HMGB1在血清中的含量与肝纤维化程度相关，HMGB1在血清中的含量越高，肝纤维化越严重。HMGB1与早期炎症因子IL-1β及TNF-α呈正相关（rIL-1β2=0.99、rTNF-α2=0.97），表明在肝纤维化大鼠血清中，HMGB1的含量与IL-1β及TNF-α的含量有密切关系。本课题组前期研究发现，老鼠簕乙醇提取物能够抑制CCl4性肝纤维化大鼠肝组织TLR4的表达[14]，提示HBOA抗CCl4性大鼠肝纤维化的作用机制可能是抑制炎症因子HMGB1的分泌，并通过抑制其受体TLR4，从而抑制TLR4-MyD88-NF-κB通路，进一步抑制促炎介质IL-1β、TNF-α 等的释放，降低 HSCs 活性，修复已损伤的肝组织，最终逆转纤维化进程。
综上所述，HBOA能够减轻CCl4所致大鼠肝纤维化程度，其作用机制可能与抑制晚期炎症因子HMGB1表达有关。最终通过上游通路减少其他炎症因子IL-1β 、TNF-α 等的释放，又通过下游通路减少细胞损伤引起的肝细胞凋亡、坏死及巨噬细胞系统激活而产生HMGB1，降低炎症反应，从而减少HSC活化，抑制ECM产生，最终减轻肝纤维化程度。然而，其具体的分子生物学机制还有待进一步研究。
( 致谢: 本实验在广西医科大学药理学实验室、实验动物中心及医学科学实验中心完成。感谢实验室老师们在实验期间的帮助。 )
| [1] | 《全国中草药汇编》编写组. 全国中草药汇编[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1978 : 231 . Chinese herbal medicine collection editors. Chinese herbal medicine collection[M]. Beijing: People′s Medical Publishing House, 1978 : 231 . |
| [2] | Wai K K, Liang Y E, Zhou L J, et al. The protective effects of Acanthus ilicifolius alkaloid A and its derivatives on pro- and anti-inflammatory cytokines in rats with hepatic fibrosis[J]. Biotechnol Appl Biochem, 2015, 62 (4): 537-46. doi:10.1002/bab.2015.62.issue-4 |
| [3] | 张自力, 赵士峰, 许文萱, 等. 细胞因子信号转导抑制分子-3 在肝纤维化中的作用及研究进展[J]. 中国药理学通报, 2015, 31 (12) : 1646-51. Zhang Z L, Zhao S F, Xu W X, et al. Research progress of role of SOCS-3 in treating liver fibrosis[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31 (12): 1646-51. |
| [4] | 李留成, 高建, 李俊. HMGB1在呼吸系统疾病中的作用及其机制[J]. 中国药理学通报, 2015, 31 (1) : 15-8. Li L C, Gao J, Li J. Role and mechanisms of HMGB1 in respiratory diseases[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31 (1): 15-8. |
| [5] | Yang H, Tracey K J. Targeting HMGB1 in inflammation[J]. Biochim Biophys Acta, 2010, 1799 (1-2): 149-56. doi:10.1016/j.bbagrm.2009.11.019 |
| [6] | Lee J H, Jang E J, Seo H L, et al. Sauchinone attenuates liver fibrosis and hepatic stellate cell activation through TGF-β/Smad signaling pathway[J]. Chem Biol Interact, 2014, 224 : 58-67. doi:10.1016/j.cbi.2014.10.005 |
| [7] | 陈琴, 陈连云, 金欢欢, 等. 肝脏树突状细胞在肝纤维化中的作用[J]. 中国药理学通报, 2015, 31 (8) : 1053-6. Chen Q, Chen L Y, Jin H H, et al. Role of dendritic cells in hepatic fibrosis[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31 (8): 1053-6. |
| [8] | 汶海琪, 罗勇, 陈瑞芳, 等. HMGB1 基因沉默对氧糖剥夺/复氧所致星形胶质细胞损伤的保护作用[J]. 解放军医学杂志, 2014, 39 (4) : 302-6. Wen H Q, Luo Y, Chen R F, et al. Protective effect of HMGBl gene silence on astrocyte injury caused by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation[J]. Med J Chin PLA, 2014, 39 (4): 302-6. |
| [9] | 邢媛, 赵中夫, 刘明社, 等. 高迁移率族蛋白B1与晚期糖基化终末产物受体结合对激活肝星状细胞的作用[J]. 中国药物与临床, 2011, 11 (11) : 1251-3. Xing Y, Zhao Z F, Liu M S, et al. Activating hepatic stellate cell by high mobility protein B1 contacting to RAGE[J]. Chin Remed Clin, 2011, 11 (11): 1251-3. |
| [10] | Kim T H, Yoon S J, Lee S M. Genipin attenuates sepsis by inhibiting Toll-like receptor signaling[J]. Mol Med, 2012, 18 : 455-65. doi:10.1007/s00894-011-1063-y |
| [11] | Carbone M, Yang H. Molecular pathways:targeting mechanisms of asbestos and erionite carcinogenesis in mesothelioma[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18 (3): 598-604. doi:10.1158/1078-0432.CCR-11-2259 |
| [12] | Bai L, Kong M, Zheng Q, et al. Inhibition of the translocation and extracellular release of high-mobility group box 1 alleviates liver damage in fibrotic mice in response to D-galactosamine/lipopolysaccharide challenge[J]. Mol Med Rep, 2016, 13 (5): 3835-41. |
| [13] | 杨新英.高迁移率族蛋白B1 抑制剂防治肝纤维化的实验研究[D].石家庄:河北医科大学, 2011. Yang X Y. The relevance of high mobility group protein B 1 and remedial potential of inhibition with hepatic fibrosis[D].Shijiazhuang: Hebei Medical University,2011. |
| [14] | 梅燕, 侯软玲, 林军. 老鼠簕对四氯化碳致肝纤维化大鼠Toll样受体4表达的影响[J]. 新乡医学院学报, 2012, 29 (2) : 93-5. Mei Y, Hou R L, Lin J. Effect of Acanthus ilicifolius Linnseus on Toll-like receptor 4 expressions of hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats[J]. J Xinxiang Med Coll, 2012, 29 (2): 93-5. |