2. 深圳市第二人民医院中心实验室，广东 深圳 518000
2. the Second People’s Hospital of Shenzhen,Shenzhen Guangdong 518000，China
甲基莲心碱（neferine，Nef）是从睡莲科植物莲成熟种子的绿色胚芽中提取出的一种双苄基异喹啉类生物碱。近年来研究表明，甲基莲心碱具有明显的抗肝纤维化作用，亦对耐药肝癌具化疗增敏作用[1-3]，但甲基莲心碱抗肝癌作用及其机制尚未明确。Rho（rashomologue）是近年来发现的一种小分子G蛋白，RhoA、RhoC为Rho蛋白的亚家族成员，而Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated coiled coil forming protein kinase,ROCK）为RhoA下游蛋白[4]。研究发现，Rho信号通路与肝纤维化的形成、肝癌的侵袭和转移密切相关[5-6]。本文以人肝癌细胞株HepG2和Bel-7402为研究对象，通过观察甲基莲心碱对HepG2和Bel-7402细胞增殖、侵袭的影响以及Rho相关蛋白的表达，探讨甲基莲心碱对人肝癌细胞的作用及机制，为甲基莲心碱的临床应用奠定实验基础。
1 材料与仪器 1.1 细胞株人肝癌细胞HepG2和Bel-7402均购自中科院上海细胞库。
1.2 药物与试剂甲基莲心碱（批号：052M4732V）购自美国Sigma公司，1 mol·L-1 HCl溶解，制成1 mmol·L-1的甲基莲心碱溶液，4℃避光保存，用时稀释成不同浓度的工作液。高糖DMEM培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；CCK-8试剂盒购自联科生物技术有限公司；兔抗人RhoA、RhoC和ROCK单克隆抗体购自武汉三鹰技术有限公司；ECL化学发光显色试剂盒购自美国Thermo公司。
1.3 仪器CO2恒温培养箱（美国Thermo）；低温高速离心机（美国Eppendorf）；酶标仪（美国ThermoFisher Scientific）；光学显微镜（日本Olympus）；倒置相差显微镜（德国Leica）。
2 方法 2.1 细胞培养人肝癌细胞HepG2和Bel-7402，在37℃、5% CO2饱和湿度条件下，10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中培养，观察细胞生长情况，每2 d传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。
2.2 CCK-8检测细胞增殖取对数生长期的人肝癌细胞HepG2和Bel-7402，胰酶消化后制成细胞悬液，调整细胞密度至4×107·L-1，细胞悬液移至96孔板，每孔100 μL，预培养12 h待细胞贴壁。培养板加入10 μL不同浓度的甲基莲心碱，设5个浓度梯度，分别为0、0.75、1.5、3、6 μmol·L-1，处理0、12、24 h，每孔加入10 μL CCK-8反应液，孵育1 h，酶标仪测定各组在450 nm处吸光度值（OD 450）。取最佳用药时间和用药浓度继续如下实验。
2.3 Transwell细胞体外侵袭实验冰上将融化后的BD Matrigel用冰的高糖DMEM稀释4倍，混匀，往预冷的Transwell板上室加稀释后的Matrigel，每孔50 μL，均匀铺平，并置于细胞培养箱中孵育3~4 h。消化已用无血清高糖DMEM饥饿的HepG2和Bel-7402细胞，细胞计数，调整细胞浓度为4×108·L-1，离心，弃上清液后，分别用100 μL 0.1% BSA培养液配制的甲基莲心碱重悬细胞，加入Matrigel已成胶的Transwell上室中，下室加入600 μL 10%胎牛血清培养液，置于培养箱中孵育。24 h后取出Transwell板，移去培养液，PBS清洗Transwell小室，4%多聚甲醛固定，无水甲醛透化，0.1%结晶紫染色，棉签轻轻擦拭没有侵袭的细胞及基质胶，干燥后，倒置显微镜下随机视野观察并拍照。
2.4 蛋白免疫印迹法检测Rho相关蛋白的表达将对数生长期的细胞，每孔106个接种于6孔板，最佳浓度的甲基莲心碱处理12 h后，收集细胞，裂解液裂解细胞，4℃、10 000 r·min-1离心10 min，获得蛋白样品。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。蛋白变性后，30~50 ng蛋白样品上样，十二烷基硫酸钠凝胶电泳2 h，湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗（1∶500）4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗 (1∶5 000 HRP标记的羊抗兔IgG)室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL曝光液发光，凝胶成像仪扫描拍照。
2.5 统计学处理采用SPSS17.0统计处理，计量资料用x±s表示，组间比较采用F检验。
3 结果 3.1 甲基莲心碱对HepG2和Bel-7402细胞增殖的影响采用不同浓度甲基莲心碱分别于12 h和24 h干预HepG2和Bel-7402细胞增殖，CCK-8实验结果分析发现，甲基莲心碱干预HepG2细胞12 h时，甲基莲心碱浓度≥ 3 μmol·L-1明显抑制细胞的增殖；作用24 h时，其浓度≥0.75 μmol·L-1明显抑制细胞的增殖（Fig 1A、Tab 1）。甲基莲心碱干预Bel-7402细胞12 h时，其浓度≥1.5 μmol·L-1明显抑制细胞的增殖；作用24 h时，其浓度≥0.75 μmol·L-1明显抑制细胞的增殖（Fig 1B、Tab 1）。采用甲基莲心碱最低有效浓度和最短作用时间，当甲基莲心碱3 μmol·L-1、作用12 h时，与对照组相比，差异具有显著性（P＜0.01），后续实验均采用12 h为干预时间，3 μmol·L-1为干预浓度。
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| Fig 1 Effect of neferine on proliferationof HepG2 (A) and Bel-7402 (B) cells(x±s，n=4) *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group |
| Concentration/μmol·L-1 | HepG2 inhibitory rate/% | Bel-7402 inhibitory rate/% | |||
| 12 h | 24 h | 12 h | 24 h | ||
| Control（0） | 0.00±0.10 | 0.00±0.29 | 0.00±0.07 | 0.00±0.11 | |
| 0.75 | 0.93±0.92 | 19.77±0.12* | 11.97±0.06 | 8.97±0.09* | |
| 1.5 | 11.35±0.05 | 58.7±0.03** | 15.31±0.06** | 59.38±0.02** | |
| 3 | 19.77±0.02** | 73.67±0.01** | 18.83±0.04** | 67.40±0.01** | |
| 6 | 23.46±0.03** | 90.70±0.00** | 21.03±0.05** | 87.57±0.01** | |
| *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group | |||||
Transwell侵袭实验显示，甲基莲心碱干预HepG2和Bel-7402细胞后，细胞侵袭能力明显减弱，甲基莲心碱3 μmol·L-1时明显抑制HepG2和Bel-7402细胞的侵袭（Fig 2）。
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| Fig 2 Analysis of invasion ability of HepG2 andBel-7402 cells after neferine treatment |
3 μmol·L-1甲基莲心碱作用HepG2和Bel-7402细胞12 h后，蛋白印迹结果表明，3 μmol·L-1甲基莲心碱即能明显抑制HepG2和Bel-7402细胞RhoA、RhoC和ROCK蛋白的表达水平（Fig 3）。
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| Fig 3 Protein expression of RhoA,RhoC andROCK after treatment HepG2 and Bel-7402 cells with neferine |
肝细胞癌是一种恶性程度极高的消化系统恶性肿瘤，是全世界癌症死亡的第三大原因，对经济发展及相关人群的生活质量造成了极大的负面影响[7]。肝癌极高的转移复发率是提高患者生存率的主要障碍，肿瘤的局部浸润和远处转移是肝癌病人死亡的主要原因[8]。因此，寻找能抑制肿瘤侵袭和转移的药物具有重要的临床意义。
以往研究表明，甲基莲心碱具有扩血管、降压、抗心律失常、抗血小板聚集、抗血栓形成、抗氧化、抗有机磷农药中毒、抗瘢痕形成、抑制肝纤维化的形成以及化疗、增敏等药理作用，近年来，甲基莲心碱对肿瘤的抑制作用引起研究学者的关注[9]。本研究利用CCK-8法检测细胞活性实验发现甲基莲心碱明显抑制人肝癌细胞HepG2和Bel-7402的增殖，且呈浓度依耐性。Transwell细胞体外侵袭实验利用Matrigel包被的小室来模拟人体内基质环境，研究肿瘤细胞的侵袭能力[10]，本实验结果显示，3 μmol·L-1甲基莲心碱明显抑制HepG2和Bel-7402细胞的侵袭。
Rho通路中的细胞黏附相关蛋白、细胞定位相关蛋白与肿瘤侵袭密不可分[11]。RhoA作为调节肌动蛋白骨架的关键分子，通过引发下游信号ROCK的激活，调节肌动蛋白和肌球蛋白收缩、影响肝星状细胞迁移、基质代谢及细胞因子的调节，从而参与肝纤维化和肝癌的形成，促肿瘤侵袭与转移。RhoC不参与肿瘤的形成，但可通过调节细胞肌动蛋白骨架、诱导肌动蛋白、整合素及相关蛋白聚集等途径，调控肿瘤细胞的侵袭和转移。RhoA和 RhoC还可通过 ROCK信号转导通路促进肿瘤血管生成，同时协助肿瘤细胞穿越脉管内皮向远处转移[11]。本研究结果表明，3 μmol·L-1甲基莲心碱明显抑制HepG2和Bel-7402细胞RhoA、RhoC和ROCK蛋白的表达。本实验结果提示，甲基莲心碱抑制肝癌细胞侵袭的作用可能是通过抑制肝癌细胞Rho/ROCK信号通路而实现。甲基莲心碱通过抑制肝星状细胞的增殖活化，抑制肝纤维化[1]，而肝纤维化可发展成肝硬化乃至肝癌[12]。结合甲基莲心碱抑制人肝癌HepG2和Bel-7402细胞增殖和侵袭的研究结果，说明甲基莲心碱具抗肝癌的作用。在今后的研究中，我们将进一步选用不同恶性程度的多种肝癌细胞株，比较并研究甲基莲心碱对其他肝癌细胞侵袭、转移及黏附能力的影响及作用机制，并通过体内动物实验来进一步探究其作用机制，为肝癌的治疗提供新的思路。
( 致谢: 本文全部实验均在深圳市第二人民医院中心实验室完成，特此致谢！ )
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