2. 山西医科大学 药理学教研室，山西 太原 030001;
3. 山西医科大学 第一医院内分泌科，山西 太原 030001
2. Dept of Pharmacology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China ;
3. Dept of Endocrinology of the First Hospital,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
国际糖尿病联盟调查显示，截至2013年，全球约有4亿糖尿病患者，预计2040年将达到6.42亿，而糖尿病每年的死亡人数已经高达500万[1]。可见糖尿病已经严重威胁到全球公民的健康。糖尿病常常伴有血糖的升高，而胰岛素的分泌增加是对血糖升高的直接反应，同时，血液中其他营养物质也可以增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌，例如氨基酸、脂肪酸等[2]。当血液中葡萄糖浓度升高时，三羧酸循环活动加强，ATP生成增多，ATP/ADP比值升高，ATP敏感性钾通道（KATP）关闭，进而细胞膜去极化，电压依赖性钙通道开放，钙内流导致细胞Ca2+浓度增加，促进胰岛素囊泡的胞吐作用[3-4]。研究证实[5]，1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）可以刺激葡萄糖依赖性的胰岛素分泌（glucose-stimulated insulin secretion，GSIS），但其作用机制目前并不清楚。本研究通过分离SD大鼠胰岛和细胞，验证S1P是否通过抑制Kv电流和升高细胞内Ca2+浓度，从而促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物8~10周龄的♂ SD大鼠，体质量250 g~280 g，由山西医科大学实验动物中心提供。生产许可证号：SCXK（晋）2015-0001。
1.1.2 试剂S1P（美国Cayman,批号：0467600-11）；胶原酶P（瑞士Roche，批号：11104222）； D-葡萄糖（北京索莱宝，批号：405A0918）；BSA（北京索莱宝，批号：831O0513）；HEPES（北京索莱宝，批号：710B048）；青链霉素（北京索莱宝，批号：20150909）；Histopaque 1077（美国Sigma，批号：RNBF1783）；胎牛血清（上海生工，批号：B326FA0092）；RPMI 1640培养基（上海生工，批号：C518FA0002）；Dispase Ⅱ（美国Amresco，批号：10888700）；胰岛素检测试剂盒（北京北方生物技术研究所，批号：20160320）。
1.1.3 仪器电子天平（上海精密，型号：GB/T26497）；体式显微镜（上海中恒，型号：SM262）；倒置显微镜（日本OLYMPUS，型号：AE-2000）；台式离心机（长沙湘仪，型号：SC-3610）；细胞培养箱（北京博奥恒信生物科技，型号：HF100）；MODEL电极拉制仪（日本Narishige，型号：PP-830）；MIRO FORGE抛光仪（日本Narishige，型号：MF-200）；EPC10全自动膜片钳（德国HEKA，型号：MP-285）；钙成像（北京MDE，型号：LAMBDA 10-B）。
1.2 方法 1.2.1 胰岛及细胞的分离和培养① 使用断头法处死大鼠，1 g·L-1胶原酶P溶液（不含血清的RPMI 1640培养基溶解）消化胰腺，37℃水浴消化、Histopaque 1077梯度离心后，在体显微镜下手工挑取胰岛，将挑好的胰岛加入培养液后，放入37℃恒温孵箱中培养[3]。② 5 g·L-1 Dispase Ⅱ溶液（PBS溶解）消化状态良好的胰岛为单个细胞，离心后，均匀滴在预先滴过细胞黏附剂的玻片上，加入培养液后，放至37℃恒温孵箱中培养[3]。
1.2.2 胰岛素分泌实验KRBH缓冲液成分（mmol·L-1）：644.0 NaCl、24.0 KCl、6.0 KH2PO4、6.0 MgSO4、12.5 CaCl2·2H2O、50 HEPES，此外，每100 mL KRBH缓冲液中再加入0.042 g NaHCO3、2 g BSA。酸乙醇成分（mL·100mL-1）：75无水乙醇、23.5蒸馏水、1.5浓盐酸。实验共4组，每组7个管，每管挑入大小均一，状态良好的5个胰岛。① 每组在低糖（2.8 mmol·L-1，LG）KRBH孵育液中孵育1 h，弃上清。② 分别在含S1P 0、5、10、20 μmol·L-1的低糖KRBH孵育液中孵育30 min，收集上清液待测。③ 分别在含S1P 0、5、10、20 μmol·L-1的高糖（16.7 mmol·L-1，HG）KRBH孵育液中孵育30 min，收集上清液待测。④ 每管加入500 μL的酸乙醇，超声粉碎仪粉碎胰岛组织，稀释80 000倍后留取待测。待测样本均使用放射免疫方法测胰岛素含量。
1.2.3 膜片钳技术记录Kv电流细胞外液成分（mmol·L-1）：141.9 NaCl、5.6 KCl、1.2 MgCl2、5.0 HEPES、11.1葡萄糖，pH=7.40。细胞内液成分（mmol·L-1）：140.0 KCl、1.0 MgCl2、0.05 EGTA、10.0 NaCl和10.0 HEPES ，pH=7.30。① 细胞膜电容>7pF的为β细胞，在-70 mV的钳制电压下给予-70~80 mV电压刺激400 ms，每次递增10 mV,检测Kv电流。② 细胞外液中加入S1P（10 μmol·L-1），方法同上，观察Kv电流变化情况。
1.2.4 钙成像技术检测细胞内Ca2+浓度使用含有2 μmol·L-1 Fura-2AM的低糖（2.8 mmol·L-1）染液孵育胰岛细胞后，置于高糖（16.7 mmol·L-1）溶液中，在510 nm发射波长、380 nm和340 nm激发波长下，可得到F340/F380的比值。在高糖条件下，观察不同浓度S1P（0、5、10、20 μmol·L-1）干预前后的F340/F380的变化。
1.2.5 统计学处理计量资料以x±s表示，用Sigmaplot12.0软件分析，两组之间用t检验，多组之间用方差分析。膜片钳数据用Pulsefit软件、Igor软件分析。
2 结果 2.1 分离的SD大鼠胰岛及细胞如Fig 1所示，分离的大鼠胰岛质地均一，状态良好，边缘圆润，胰岛细胞状态良好，包膜完整。
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| Fig 1 Rat pancreatic islets and cells A：Isolated rat pancreatic islets digested by collagenase P（×10）； B： Isolated rat pancreatic islet cells digested by Dispase Ⅱ（×40） |
每组7个管（每管5个胰岛），在低糖和高糖下，不同浓度S1P（0、5、10、20 μmol·L-1）干预，观察胰岛素分泌的变化，所测胰岛素以2.8 mmol·L-1葡萄糖为标准，标化后结果见Tab 1。与低糖比较，高糖明显刺激了胰岛素分泌（P<0.01）。低糖条件下，S1P干预后，胰岛素含量没有明显变化（P>0.05）。高糖条件下，S1P浓度依赖性刺激了胰岛素的分泌（P<0.01）。
| Group | S1P/μmol·L-1 | |||
| 0 | 5 | 10 | 20 | |
| LG | 1.000 0±0.179 2 | 1.023 3±0.190 8 | 1.005 9±0.216 7 | 0.888 5±0.104 6 |
| HG | 1.655 1±0.133 4## | 2.102 2±0.136 0 | 2.462 1±0.177 0* | 2.741 0±0.257 7** |
| LG: low glucose(2.8 mmol·L-1) ,HG: high glucose (16.7 mmol·L-1). ##P<0.01 vs LG group（S1P 0 μmol·L-1）;*P<0.05,**P<0.01 vs HG group（S1P 0 μmol·L-1） | ||||
在-70 mV的钳制电压下给予-70~80 mV电压刺激400 ms，每次递增10 mV,检测Kv电流。与对照组相比，S1P（10 μmol·L-1）明显抑制了Kv电流[对照组(110.714 6±4.811 3) pA/pF，n=8；S1P组(68.094 3±2.927 1) pA/pF，n=8；P<0.01]（Fig 2）。
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| Fig 2 S1P inhibits Kv currents of pancreatic beta cells A,B：Representive current traces recorded under control and S1P treatment conditions from rat beta cells； C： Current-voltage curves of Kv channels under control and S1P treatments conditions； D： Summary of the mean current density of Kv channels recorded at 80 mV depolarization. **P<0.01 vs control group. |
使用含2 μmol·L-1Fura-2 AM低糖染液孵育细胞后，置于高糖溶液中，在510 nm发射波长、380 nm和340 nm激发光下，测得F340/F380。不同浓度S1P（0、5、10、20 μmol·L-1）干预，可以看到S1P浓度依赖性增加了细胞内Ca2+浓度，以S1P（0 μmol·L-1）为标准标化，结果如下： 0 μmol·L-1 ，1.000 0±0.039 3，n=5；5 μmol·L-1,1.152 8±0.049 3，n=5；10 μmol·L-1,1.382 8±0.063 4，n=5；20 μmol·L-1,1.718 8±0.031 2，n=5。见Fig 3。
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| Fig 3 S1P increases the level of intracellular Ca2+ of pancreatic beta cells A： The changes of fluorescence intensity after S1P treatments from beta cells； B： Traces show the changes of intracellular Ca2+ level after S1P treatments under high glucose condition； C： The ratio of fluorescence intensity (F340/F380) after S1P treatments,five cells were tested.**P<0.01 vs control. |
糖尿病的发病率逐年上升，已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后第3位严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病[6]。1型糖尿病发病机制主要是胰岛素绝对缺乏，2型糖尿病则主要是胰岛素抵抗伴有胰岛素分泌不足，但两者共同的核心病理环节都是β细胞功能的衰退[7]。鞘脂类代谢产物S1P是一种有活性的脂质分子，在细胞内外均发挥重要作用，已经证实，在肿瘤、心血管疾病、骨代谢及糖尿病方面均有明显作用[8-10]。本实验中，与低糖相比，高糖明显刺激了胰岛素分泌。S1P干预后，低糖条件下并没有影响胰岛素分泌，而在高糖条件下，浓度依赖性促进了胰岛素分泌。在Hasan等[11]研究中发现，S1P可以促进β细胞的生存和生长，抑制其凋亡，促进GSIS。在研究中发现，高糖可以激活鞘氨醇激酶2（SphK2），增加S1P的生成，促进GSIS[5]。本实验中，在高糖条件下，S1P明显抑制了β细胞的Kv电流，减少钾外流。研究已经证明Kv通道参与动作电位的形成，抑制Kv电流可以延长动作电位时程、升高细胞内钙浓度，从而促进胰岛素分泌[3]。细胞内的S1P可以调节钙动员，升高细胞内的Ca2+水平，促进β细胞生长，抑制其凋亡[11-12]。本实验证实高糖条件下，S1P干预后，浓度依赖性增加了细胞内的Ca2+水平，而Ca2+作为细胞内的第二信使，可以调节众多过程，其中包括增加胰岛素分泌。我们推测，S1P可能通过抑制Kv电流，延迟了动作电位时程，进而增加钙离子内流，导致细胞内钙增加，从而促进了胰岛素分泌。
综上，本实验通过分离和培养SD大鼠原代胰岛、细胞，证实了S1P可能通过抑制细胞Kv电流、升高胰岛细胞内Ca2+浓度，最终促进了葡萄糖刺激的胰岛素分泌。此结果对于胰岛素促泌剂的研发提供了实验依据，为糖尿病的治疗提供了新的治疗方向。但关于S1P促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌的下游信号通路仍待进一步研究。
( 致谢: 本文实验在山西医科大学药理教研室章毅老师实验室完成，在此对参与实验的人员表示感谢。 )
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