2. 潍坊医学院医学研究实验中心, 山东 潍坊 261053;
3. 潍坊医学院护理学院, 山东 潍坊 261053
2. Medicine Research Center, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China ;
3. Colloge of Nursing, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China
乳腺癌(breast cancer，BC)是世界范围内严重危害女性健康的恶性肿瘤，具有高转移率和高复发率，肿瘤细胞从原发病灶脱落，浸润周围组织及发生远处转移是乳腺癌难以治愈的关键[1]。白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)主要由单核细胞和内皮细胞分泌，能激活细胞表面趋化因子受体的多个细胞内下游信号通路，其分泌在正常细胞中受到严格控制[2]，Zuccari等[3]利用免疫组织化学技术检测72例乳腺癌标本，结果发现IL-8在乳腺癌中的表达高于正常乳腺组织。IL-8表达增多具有促进血管生成和肿瘤形成的功能，参与肿瘤的发生、发展和转移过程。吞噬细胞运动蛋白1(engulfment and cell motility 1, ELMO1)是进化上非常保守的一种蛋白质，主要介导细胞的吞噬、移动和形态改变，ELMO蛋白在肌动蛋白细胞骨架和微管网络中发挥重要作用，调节细胞运动能力[4]。在乳腺癌细胞水平上，利用基因沉默技术降低ELMO1蛋白的表达能够抑制乳腺癌细胞迁移、趋化运动和侵袭能力[5]。众多研究表明IL-8和ELMO1均与乳腺癌细胞的侵袭和转移密切相关，而目前对于ELMO1在IL-8诱导的乳腺癌侵袭和转移中的作用尚未见报道。因此，本实验利用小RNA干扰技术和过表达质粒分别下调和上调乳腺癌细胞中ELMO1蛋白的表达，通过体外侵袭实验和趋化运动实验检测转染后MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞在IL-8诱导下的侵袭和运动能力的变化，从而探讨IL-8及ELMO1在乳腺癌侵袭和转移中的作用及可能的分子机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂β-actin购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗ELMO1单抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；RPMI 1640培养基购自上海拜力生物科技有限公司；胎牛血清购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；胰蛋白酶购自北京索莱宝公司；彩色预染蛋白P0068购自上海碧云天公司；无内毒素质粒中量提取试剂盒购自康为世纪；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂购自Invitrogen公司，侵袭试验所用小室购自康宁公司，基质胶(Matrigel)购自碧迪医疗器械(上海)有限公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7在含10% FBS的RPMI 1640培养基，37℃，5% CO2培养箱培养。细胞传代3次以上，在对数生长期进行实验。
1.2.2 细胞转染将细胞悬液均匀铺于6孔板中培养过夜，细胞长到约70%，按照Lipofectamine 2000的使用说明书进行操作。用于转染的ELMO1特异性小RNA干扰质粒及过表达质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。
1.2.3 Western blot将培养的细胞裂解提取蛋白，制备SDS-PAGE凝胶，用移液器加入等量所提各组蛋白，电泳、转膜、封闭，加入一抗ELMO1(1:500)、β-actin(1:1 000)孵育过夜，洗膜，二抗(1:5 000)孵育后显影，曝光。
1.2.4 趋化运动实验将对照细胞和经过处理的细胞分别重悬于RPMI 1640培养液中，细胞计数(5×108·L-1)。在趋化小室下层中加入趋化因子IL-8，含10% FBS的RPMI 1640培养基500 μL，将细胞悬液200 μL加入上层中，然后将趋化小室放入37℃，5% CO2培养箱，培养24 h后，将滤膜上层细胞用棉签擦去，下室固定、洗涤并染色。高倍镜(400×)下观察，随机计数3个高倍镜视野下穿过人工基膜的细胞数，每个实验重复3次，取平均数作为实验结果。
1.2.5 Transwell细胞侵袭实验按文献操作[6]，应用8 μm滤膜transwell小室，铺一层人工基质胶(matrigel)室温下干燥。将胰酶消化后重悬的各组细胞悬液(5×108·L-1)200 μL分别加入小室上室中。下室加入500 μL含10% FBS的RPMI 1640培养基，加入或不加入100 μg·L-1 IL-8。37℃，5% CO2培养24 h。弃去培养基，用棉签擦尽上室面的人工基质胶和细胞，下室面固定染色。每孔随机取5个高倍镜(400×)视野，计数下室面的细胞数即为穿透人工基底膜的细胞数，每个实验重复3次，取平均数作为实验结果。
1.3 统计学分析实验数据以x±s表示，数据资料用PASW软件进行处理，计量资料用独立样本t检验或单因素方差分析，计数资料用卡方检验。P < 0.05，表示差异无统计学意义。
2 结果 2.1 IL-8刺激影响乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的趋化运动能力用1、10、50、100 μg·L-1 4种不同剂量的IL-8刺激乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7 24 h，结果显示：在未用IL-8干预的情况下，乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7趋化运动能力较弱，IL-8刺激后，2种不同细胞的趋化运动能力明显增加，具有剂量依赖性(Fig 1)。
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| Fig 1 Comparison of IL-8 induced chemotaxisof different breast cancer cell lines IL-8 induced the robust chemotaxis of different breast cancer cell lines(MDA-MB-231 and MCF-7). Columns mean of triplicate measurements: bars, standard deviation |
用Western blot检测人正常乳腺上皮细胞MCF-10A和人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中ELMO1的表达，结果显示：ELMO1蛋白在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中高表达，在正常乳腺上皮细胞MCF-10A和人乳腺癌细胞MCF-7中低表达(Fig 2)。
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| Fig 2 Expression of ELMO1 in MCF-10A cells, MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells(Values represent gray value) |
瞬时转染干扰质粒72 h后，Western blot结果显示在siELMO1/MDA-MB-231细胞中ELMO1的表达明显低于Scr/MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231细胞中的表达。转染过表达质粒72 h后，Western blot结果显示在MCF-7/ELMO1细胞中ELMO1的表达明显高于Scr/MCF-7细胞中的表达(Fig 3)。
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| Fig 3 Expression of ELMO1 in transfectedcells by Western blot(Values represent gray value) A:Expression of ELMO1 protein in MDA-MB-231, Scr/MDA-MB-231 and siELMO1/MDA-MB-231 cells; B: Expression of ELMO1 protein in MCF-7, MCF-7/Con and MCF-7/ELMO1 cells |
为了检测ELMO1表达改变对IL-8诱导的乳腺癌细胞迁移能力的影响，我们进行了细胞趋化运动实验，结果显示：在IL-8(100 μg·L-1)刺激下，siELMO1/MDA-MB-231细胞趋化运动能力与MDA-MB-231细胞和Scr/MDA-MB-231细胞相比明显降低(P < 0.01)，差异有统计学意义。MCF-7/ELMO1细胞的趋化运动能力与MCF-7细胞和Scr/MCF-7细胞相比明显增强(P < 0.01)，差异有统计学意义(Fig 4)。
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| Fig 4 The chemotaxis ability of each group transfected MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells(Giemsa×400) A:Comparison of chemotacitc responses with IL-8 stimulation in MDA-MB-231, Scr/MDA-MB-231 and SiELMO1/MDA-MB-231 cells. The chemotaxis index in SiELMO1/MDA-MB-231 decreased compared with Scr/MDA-MB-231.**P < 0.01; B: Comparison of chemotacitc responses with IL-8 stimulation in MCF-7, MCF-7/Con and MCF-7/ELMO1 cells. The chemotaxis index in MCF-7/ELMO1 increased compared with MCF-7/Con.**P < 0.01;C:Scr/MDA-MB-231 cell, 24 h; D: SiELMO1/MDA-MB-231 cells, 24 h; E: Scr/MDA-MB-231 cell, 48 h; F: SiELMO1/MDA-MB-231 cells, 48 h; G: MCF-7/Con cell, 24 h; H: MCF-7/ELMO1 cells, 24 h; I: MCF-7/Con cell, 48 h; J: MCF-7/ELMO1 cells, 48 h |
肿瘤细胞向细胞外基质的侵袭与细胞的迁移能力密切相关，肿瘤细胞迁移能力的降低通常会导致细胞的侵袭能力的降低，以上研究证明，IL-8和ELMO1可以调节乳腺癌细胞的趋化运动能力，因此，我们通过基质胶(matrigel)模拟体内细胞外基质，用Transwell小室来检测乳腺癌细胞的侵袭能力，用100 μg·L-1的IL-8作为趋化因子吸引乳腺癌细胞穿透基质胶和滤膜。结果显示：在IL-8(100 μg·L-1)刺激下，siELMO1/MDA-MB-231组穿过人工基底膜进入下室的细胞数量比Scr/MDA-MB-231组明显减少(P < 0.05)，差异有统计学意义(Fig 5)。MCF-7/ELMO1组穿过人工基底膜进入下室的细胞数量比Scr/MCF-7组明显增多(P < 0.05)，差异有统计学意义(Fig 5)。
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| 图 5 Invasion ability of each group transfectedMDA-MB-231 cells and MCF-7 cells A:Quantification IL-8 induced penetrated cells was performed in Scr/MDA-MB-231 and SiELMO1/MDA-MB-231 cells by transwell invasion assay. The number of invasive cells in SiELMO1/MDA-MB-231 decreased compared with Scr/MDA-MB-231.*P < 0.05(two-way ANOVA); B: Quantification IL-8 induced penetrated cells was performed in MCF-7/Con and MCF-7/ELMO1 cells by transwell invasion assay. The number of invasive cells in MCF-7/ELMO1 increased compared with MCF-7/Con.*P < 0.05(two-way ANOVA) |
尽管乳腺癌的治疗已经取得重大进展，但转移仍是乳腺癌患者死亡的主要原因[7]，因此抑制肿瘤细胞侵袭转移，研究其转移机制，设计靶向阻断药物对乳腺癌的进一步治疗至关重要。
IL-8具有促进肿瘤发生和血管生成的功能，在许多人类癌症中表达增高，对肿瘤的发生、发展和转移起重要作用[8]。Deng等[9]构建含IL-8基因的重组腺病毒载体，观察对乳腺癌细胞BT549增殖、细胞周期和迁移的影响。过表达IL-8促进BT549细胞迁移，抑制细胞周期在S期的DNA复制，而对BT549细胞的增殖没有明显影响。Kim等[10]发现，用IL-8处理后，三阴性乳腺癌(雌激素受体ER、孕激素受体PR、原癌基因Her-2均为阴性的乳腺癌)细胞的侵袭性明显增强。本研究通过趋化运动实验检测IL-8对乳腺癌细胞运动能力的影响，结果显示：在IL-8刺激下，乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的运动能力增强，具有剂量依赖性。结果提示IL-8与乳腺癌的侵袭转移相关。
已有研究表明，ELMO1可以促进乳腺癌细胞迁移、趋化运动和侵袭的能力，基质细胞衍生因子-1诱导的乳腺癌细胞肌动蛋白聚合和侵袭转移需要ELMO1的参与[5]。ELMO1蛋白可以和胞质分裂作用因子180(dedicator of cytokinesis 180，DOCK180)形成复合体，从而以鸟嘌呤核苷酸交换因子的角色发挥作用，通过G蛋白偶联受体介导的通路来调控Rac蛋白从而促进肌动蛋白的聚合，调控细胞迁移、趋化运动、侵袭和转移能力[11-13]。本实验Western blot检测结果显示，ELMO1蛋白在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达明显高于乳腺癌细胞MCF-7和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A中的表达，侵袭性强的MDA-MB-231细胞中ELMO1蛋白表达高于侵袭性低的MCF-7细胞中表达；降低ELMO1的表达，抑制了MDA-MB-231细胞的运动和侵袭能力，上调ELMO1的表达增强了MCF-7细胞的运动和侵袭能力。结果提示ELMO1能够促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。
IL-8依次激活PI3K、Akt和NF-κB通路，增强非嗜荷尔蒙乳腺癌细胞的侵袭能力[8]。NF-κB通路参与了PKC信号诱导的乳腺癌中IL-8表达，促进了乳腺癌细胞的迁移[14]。本课题组前期研究发现IL-8激活ELMO1-NF-κB-Snail信号通路促进胶质瘤细胞的侵袭转移，降低ELMO1的表达，抑制了IL-8诱导的胶质瘤细胞迁移[15]。但IL-8和ELMO1在乳腺癌侵袭转移中的关系尚不清楚，我们因此提出假设，IL-8通过ELMO1促进乳腺癌细胞的侵袭和转移，本实验为研究IL-8和ELMO1在乳腺癌侵袭和转移中的相互关系，采用小RNA干扰技术沉默乳腺癌细胞MDA-MB-231中内源性ELMO1基因，用过表达质粒上调乳腺癌细胞MCF-7中的内源性ELMO1基因，Western blot检测SiELMO1/MDA-MB-231细胞组ELMO1蛋白的表达降低，MCF-7/ELMO1细胞组ELMO1蛋白的表达增高。趋化运动和Transwell检测结果显示，降低ELMO1的表达抑制了IL-8诱导的MDA-MB-231细胞的运动和侵袭能力，上调ELMO1的表达增强了IL-8诱导的MCF-7细胞的运动和侵袭能力。以上结果提示，IL-8促进乳腺癌侵袭和转移是通过ELMO1实现的。
综上所述，本实验研究证实ELMO1在乳腺癌细胞MDA-MB-231中高表达，IL-8通过ELMO1促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。因此，通过减少ELMO1的表达降低IL-8对乳腺癌的影响，可以成为抑制乳腺癌侵袭转移的新的治疗方向。
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