聚乙二醇(PEG)及其功能性衍生物是药剂学及药物化学中常用的修饰剂。PEG化(PEGylation)作为蛋白类药物的重要修饰方法，目前已逐步应用于小分子药物成药性的优化过程中。小分子药物经PEG修饰，其肠道吸收等多方面的药代动力学性质会发生较大改变。已有研究证明用高分子量PEG修饰的药物，其肠道吸收会受到一定抑制[1]。5-氨基水杨酸(美沙拉嗪，5-ASA)是治疗溃疡性结肠炎(ulcerative colities，UC)的临床常用药物，其抗炎作用机制主要是抑制体内白三烯、前列腺素E及自由基的产生过程[2-3]。但该药口服后在胃和小肠中、上段被吸收代谢，不能或很少到达结肠区域病灶部位，且会产生包括肾毒性在内的一系列不良反应[2]。本课题组前期采用不同分子量的单甲氧基PEG(mPEG)对5-ASA进行修饰，得到了一系列不同分子量具有前药特性的5-ASA-mPEG修饰物。其结构式如Fig 1所示。
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| Fig 1 General chemical formula of 5-ASA-mPEG in different molecular weight |
为考察该系列化合物的肠道吸收特性，本实验采用大鼠在体单向灌流法对该系列化合物的大鼠肠道吸收过程进行考察，以揭示5-ASA-mPEG的肠道吸收机制及其动力学特征，考察PEG化对美沙拉嗪肠道吸收的影响，并对PEG修饰物分子量变化对肠道吸收的影响规律进行研究。
1 材料 1.1 仪器Agilent1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；BT00-100M蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；XS205分析天平(瑞士Mettler Toledo); TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)。
1.2 试药戊巴比妥钠(纯度>99%，北京普博斯生物)；5-ASA-mPEG350酯前药、5-ASA-mPEG1000酯前药、5-ASA-mPEG2000酯前药、5-ASA-mPEG5000酯前药(自制，纯度>98%)；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；
1.3 试验动物SD ♂大鼠(250±30)g(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，实验动物许可证号：SCXK(湘)2011-0003。
2 方法与结果 2.1 试液配置K-R试液的配制：称取葡萄糖1.4 g，CaCl2 0.37 g，分别加少量蒸馏水溶解，再称取NaHCO3 1.37 g、NaH2PO4 0.32 g、MgCl2 0.22 g、NaCl 7.52 g和KCl 0.35 g，加蒸馏水溶解后与葡萄糖及CaCl2溶液混匀，定容至1 L，并用1 mol·L-1的H3PO4调pH至6，即得；
空白大鼠肠灌流液：将K-R试液进行大鼠小肠循环灌注2 h即得，随即使用；
5-ASA-mPEG350～5000前药供试液：精密称取5-ASA-mPEG 350～5 000前药适量，置250 mL容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得，使用前配制。
2.2 色谱条件色谱柱：kromasil ODS C18(250×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)(5-ASA-mPEG350：35% A-65% B；5-ASA-mPEG 1 000：36% A-64% B；5-ASA-mPEG 2 000：38% A~62% B；5-ASA-mPEG 5 000：39% A~61% B)，柱温25℃，检测波长254 nm，流速1 mL·min-1，进样量20 μL。
2.3 方法专属性考察[4]分别取5-ASA-mPEG 350～5 000系列修饰物用K-R试液配成溶液Ⅰ，并于大鼠小肠循环灌流2 h得灌流液Ⅱ，高速离心10 min后，过0.45 μm微孔滤膜，按2.2项下条件测定，色谱图见Fig 2。结果显示，灌流后所得灌流液中的其它物质对药物测定无干扰。
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| Fig 2 HPLC chromatogram of test solution or perfusate Ⅰ:Reference substance; Ⅱ:Perfusion sample(perfusion for 2 hours); Ⅲ:Blank perfusate added reference substance; Ⅳ:Blank perfusate |
分别精密称取5-ASA-mPEG 350、5-ASA-mPEG 1 000、5-ASA-mPEG 2 000、5-ASA-mPEG 5 000等各前药0.02 mmol(质量分别为12.38、24.76、44.92、104.82 mg)置于50 mL容量瓶中，用K-R液稀释配置梯度标准溶液，摩尔浓度分别为0.40、0.30、0.20、0.15、0.10、0.07、0.05、0.03 mmol·L-1。根据2.2项下色谱条件进行测定，以峰面积对浓度回归。得各分子量5-ASA-mPEG的标准曲线方程，见Tab 1。
| Prodrugs | Standard curve | Correlation coefficient/r | Linear range/mg·L-1 |
| 5-ASA-mPEG 350 | Y=5.155X-5.631 | 0.9995 | 18.57~247.62 |
| 5-ASA-mPEG 1 000 | Y=3.697X-4.618 | 0.9999 | 37.14~495.19 |
| 5-ASA-mPEG 2 000 | Y=2.026X-0.258 | 0.9994 | 67.38~898.41 |
| 5-ASA-mPEG 5 000 | Y=0.693X-18.57 | 0.9996 | 157.23~2096.37 |
用空白大鼠肠灌流液精密配制5-ASA-mPEG 350～5 000低、中、高(0.05、0.15、0.30 mmol·L-1)3种浓度的质控样品，高速离心10 min后，过0.45 μm微孔滤膜，按2.2项下色谱条件分别进样测定。每个浓度测定5个样品，根据标准曲线计算批内变异；同法连续测定5 d，计算批间变异。样品批内、批间精密度结果(如Tab 2所示)符合生物样品测定的技术要求。
| Parameters | n | Concentration | 5-ASA-mPEG 350 | 5-ASA-mPEG 1 000 | 5-ASA-mPEG 2 000 | 5-ASA-mPEG 5 000 |
| Inter-batch RSD/% | 5 | High | 0.34 | 1.26 | 0.56 | 0.91 |
| Medium | 0.63 | 0.51 | 0.54 | 0.31 | ||
| Low | 0.61 | 0.74 | 1.25 | 1.65 | ||
| Intra-batch RSD/% | 25 | High | 0.95 | 0.77 | 1.90 | 1.35 |
| Medium | 2.62 | 0.84 | 2.15 | 1.09 | ||
| Low | 2.91 | 2.61 | 1.55 | 2.17 | ||
| Recovery/% | 5 | High | 101.47±2.65 | 99.34±0.69 | 98.60±1.34 | 98.42±0.86 |
| Medium | 103.34±1.98 | 101.29±0.95 | 98.67±1.67 | 96.54±1.63 | ||
| Low | 103.66±2.82 | 98.30±0.70 | 97.56±1.95 | 97.54±1.51 |
用空白肠灌流液配制5-ASA-mPEG 350～5 000低、中、高(0.05、0.15、0.30 mmol·L-1)3种浓度的质控样品，高速离心10 min后，过0.45 μm微孔滤膜，按2.2项下色谱条件分别进样测定。每一浓度测定5个样品，将峰面积代入标准曲线方程，求得药物的质量浓度，用测得浓度与加入浓度之比计算各药物在肠道灌流液中的回收率。见Tab 2。
2.7 代谢稳定性考察按2.1方法，将K-R液在大鼠小肠中循环灌注2 h，制备空白大鼠肠灌流液，用以考察药物在肠道中的代谢稳定性。以H3PO4调节空白大鼠肠灌流液pH值至6.0，用此灌流液配制质量浓度为0.15 mmol·L-1的5-ASA-mPEG 350～5 000溶液，37℃恒温水浴中孵化12 h，分别于0、2、4、6、8、10、12 h取样，按2.2项下色谱条件测定浓度变化。结果表明药物在12 h内基本稳定，降解率小于3%。
2.8 大鼠在体肠吸收试验 2.8.1 大鼠在体肠单向灌流方法[6-9]取禁食(可自由饮水)12 h的大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(40~50 mg·kg-1)，将麻醉大鼠固定于手术台板上，沿腹中线正中切开约3 cm，打开腹腔小心分离出待测肠段，十二指肠段为距幽门1 cm处开始，空肠段为距幽门15 cm处开始，回肠段为盲肠上行20 cm处开始，结肠段从盲肠后端开始。各段量取10 cm，待测肠段于两端切口，插管并结扎。伤口处用浸有生理盐水的纱布覆盖保湿，空调恒温30℃左右，并用红外灯辅热以保持动物体温。用预热37℃的生理盐水轻缓地将肠内容物冲洗干净，再用空气将生理盐水排净。实验时取前药供试液(预热至37℃)适量用灌流泵将其灌入相应肠段中，先以1.0 mL·min-1的流速快速灌流2 min，使其充满肠段，再以0.2 mL·min-1的流速灌流，并开始计时。预灌流45 min后开始实验，进口处用已知质量的装有供试液的小瓶进行灌流，出口处用已知质量的小瓶以每15 min为1周期分段收集流出液，每收集1次迅速精确称定供试液小瓶和收集液小瓶质量。将样品高速离心10 min，过微孔滤膜进样，测定样品中药物的浓度。最后剪取被灌流的肠段，测量肠宽度以及长度，计算肠道横截面半径。
采用重量法计算药物吸收速率常数(Ka)和表观吸收系数(Papp)。
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其中：Vin和Vout分别为肠道进出口灌流液的体积(mL)(假定灌流液密度为1.0 g·mL-1)；Cin和Cout分别为肠道进出口灌流液中药物的浓度(mg·L-1)；V为被灌流肠段内容积；l和r分别为被灌流肠段的长度(cm)和横截面半径(cm)；v为灌流速度。
2.8.2 灌流速度对药物吸收的影响将6只大鼠随机分成2组，每组3只，以浓度为0.1616 mmol·L-1的5-ASA-mPEG 1 000对空肠部位进行灌流，考察流速变化对吸收速度的影响。第一组肠道灌流速度先升后降，依次为0.2、0.4、0.8、1.0、0.8、0.4、0.2 mL·min-1，照“2.8.1”项下方法操作，用初始流速预灌流45 min后开始实验，每15 min为1周期收集灌流液，称重，并更换下一流速。更换流速后须用新流速对肠道冲洗平衡10 min。另一组灌流速度采用先降后升的方案，依次为1.0、0.8、0.4、0.2、0.4、0.8、1.0 mL·min-1，同法操作。计算各流速的Ka和Papp，比较不同灌流速度对药物肠道吸收的影响。见Tab 3。
| Perfusion rate/ mL·min-1 |
Ka/ 10-2 min-1 |
Papp/ 10-3 cm·min-1 |
| 0.2 | 0.971±0.268 | 1.301±0.304 |
| 0.4 | 2.192±0.489* | 2.480±0.490* |
| 0.8 | 2.749±0.367#△ | 2.956±0.545#△ |
| 1 | 2.870±0.311#△ | 3.291±0.434#△ |
| *P < 0.05 vs The group of 0.2 mL·min-1; #P < 0.01 vs The group of 0.2 mL·min-1; △P < 0.05 vs The group of 0.4 mL·min-1 | ||
实验结果表明，灌流速度对于药物肠道吸收有显著影响，吸收速度随灌流速度的加快而提高。为避免流速对实验结果产生影响，在本实验过程中，我们采用固定流速(0.2 mL·min-1)对肠道进行灌流。
2.8.3 药物浓度对肠道吸收的影响随机选取3只大鼠，以浓度分别为0.0404、0.1616、0.3232 mmol·L-1的5-ASA-mPEG 1 000对空肠部位进行灌流，考察药物浓度对于肠道吸收的影响。按照“2.8.1”项下方法操作，流速为0.2 mL·min-1，用初始浓度预灌流45 min后开始实验，每15 min为1周期收集灌流液，称重，每一浓度连续测定3个周期后更换下一浓度。更换浓度后须用新浓度的供试液对肠道灌流清洗平衡10 min。计算每15 min的Ka和Papp，比较不同药物浓度对肠道吸收的影响。见Tab 4。
| Concentration /mmol·L-1 |
Ka/ 10-2 min-1 |
Papp/ 10-3 cm·min-1 |
| 0.0404 | 0.970±0.311 | 1.291±0.434 |
| 0.1616 | 0.921±0.268 | 1.287±0.306 |
| 0.3232 | 1.022±0.189 | 1.480±0.390 |
实验结果表明，在实验设置浓度下，药物浓度对肠道吸收无明显影响(P>0.05)，因此可以初步判定大鼠肠道对该药物的吸收应以简单扩散过程为主，其具体吸收机制仍有待进一步研究。
2.8.4 不同肠段对药物吸收的影响随机选取5只大鼠，每只大鼠同时考察4个不同肠段。各肠段均取约10 cm，具体划分如2.8.1所述。分别称取5-ASA-mPEG 350～5 000 4种前药适量，用K-R溶液配制摩尔浓度为0.1616 mmol·L-1(质量浓度分别为100、200、363、847 mg·L-1)4种供试液，按照2.8.1项下方法分别灌流，灌流速度0.2 mL·min-1，每15 min为1个周期收集灌流液，称重。每个肠段连续测定6个周期(15 min×6)，分别计算各分子量前药在不同肠段的Ka和Papp，比较不同肠段对药物吸收的影响。见Tab 5。
| Prodrugs | Parts | Ka/10-2 min-1 | Papp/10-3 cm·min-1 |
| 5-ASA-mPEG 350 | Duodenum | 1.885±0.311 | 2.135±0.386 |
| Jejunum | 1.724±0.149 | 1.943±0.177 | |
| Ileum | 1.860±0.475 | 2.056±0. 513 | |
| Colon | 1.535±0.335 | 1.829±0.472 | |
| 5-ASA-mPEG 1 000 | Duodenum | 1.187±0.143* | 1.210±0.157* |
| Jejunum | 0.910±0.068* | 1.145±0.104* | |
| Ileum | 0.903±0.200* | 1.168±0.326* | |
| Colon | 0.847±0.272* | 1.035±0.318* | |
| 5-ASA-mPEG 2 000 | Duodenum | 0.768±0.132#△ | 0.865±0.164#△ |
| Jejunum | 0.814±0.344# | 1.017±0.392* | |
| Ileum | 0.679±0.237#△ | 0.822±0.266#△ | |
| Colon | 0.705±0.142# | 0.860±0.132#△ | |
| 5-ASA-mPEG 5 000 | Duodenum | 0.642±0.256#△ | 0.784±0.272#△▲ |
| Jejunum | 0.558±0.169#△▲ | 0.624±0.182#△▲ | |
| Ileum | 0.356±0.048#△▲ | 0.419±0.083#△▲ | |
| Colon | 0.363±0.104#△▲ | 0.441±0.148#△▲ | |
| *P < 0.05 vs 5-ASA mPEG 350; #P < 0.01 vs 5-ASA-mPEG350;△P < 0.05 vs 5-ASA-mPEG 1 000;▲P < 0.05 vs 5-ASA-mPEG 2 000 | |||
实验结果表明，各分子量前药十二指肠、空肠、回肠、结肠段吸收差异无显著性(P>0.05)，各肠段均有明显吸收，各分子量前药的吸收速率常数和表观吸收系数相近。但是随着分子量的增大，各肠段吸收值都有明显降低(P < 0.05)，其中5-ASA-mPEG 5 000相对于5-ASA-mPEG 350有极显著性差异(P < 0.01)，表明分子量变化对于该系列药物的肠道吸收存在影响，为对这一结果进行验证，本实验对药物分子量对肠道吸收的影响进行了进一步考察。
2.8.5 药物分子量对肠道吸收的影响将4种前药用K-R试液配成相同摩尔浓度的溶液(0.1616 mmol·L-1)，随机选取3只大鼠，对同一只大鼠的空肠段分别给予4种前药。照“2.8.1”项下方法操作，灌流速度0.2 mL·min-1，每15 min为1周期收集灌流液，称重。每一前药连续测定3个周期后更换下一药物，更换药物后须用新药物供试液灌流清洗10 min。计算每15 min的Ka和Papp，比较药物分子量变化对药物吸收的影响。见Tab 6。
| Molecular weight | Ka/10-2 min-1 | Papp/10-3 cm·min-1 |
| 5-ASA-mPEG 350 | 1.653±0.478 | 1.972±0.490 |
| 5-ASA-mPEG 1 000 | 0.902±0.243* | 1.189±0.256* |
| 5-ASA-mPEG 2 000 | 0.875±0.054* | 1.107±0.144* |
| 5-ASA-mPEG 5 000 | 0.643±0.159#△▲ | 0.712±0.204#△▲ |
| *P < 0.05 vs 5-ASA-mPEG 350;#P < 0.01 vs 5-ASA-mPEG 350;△P < 0.05 vs 5-ASA-mPEG 1 000;▲P < 0.05 vs 5-ASA-mPEG 2 000 | ||
实验结果表明，修饰物分子量对药物的肠道吸收存在显著性影响，随mPEG修饰基团分子量的提高，药物空肠段吸收呈下降的趋势。表明用高分子基团对药物修饰后，对药物的肠道吸收存在明显抑制作用，且其抑制作用与分子量变化存在相关性。
3 讨论 3.1 肠道吸收动力学方法探讨测定大鼠肠道吸收动力学的方法包括在体法、离体法和体内法等。其中在体肠吸收法由于实验过程中对血管、神经组织破坏低，能够基本模拟体内肠道吸收条件，并能避免肝肠循环、首过效应等过程对吸收的影响，因此被广泛采用。在体法中常见的在体肠循环实验法由于试验时间长、流速高，易造成肠道黏膜损伤而导致吸收值与真实值相比偏差较大。而在体单向灌流法能很好的模拟空腹状态下的肠道吸收情况，吸收速率较为稳定，与活体具有良好的相关性[10]，因此本实验采用在体单向灌流法对系列分子量的5-ASA-mPEG肠道吸收动力学进行考察。
3.2 校正方法探讨在体肠实验过程中，需要对肠道因水分吸收所造成的灌流液体积及药物浓度的变化进行校正。通常采用的方法有两种，一种是通过测定吸收实验前后灌流液的重量差进行校正，另一种是加入肠道不吸收的物质，如酚红、14C-PEG等作为标示物进行校正。由于标示物法存在测定繁琐复杂，酚红在肠道具有一定吸收，放射性物质对人体安全性存在影响，以及标示物对于药物的吸收及测定可能存在干扰等问题，因此本实验采用重量法进行校正。
3.3 灌流速度对药物吸收影响探讨实验结果表明，灌流液流速对肠道吸收过程有较大影响，Ka和Papp值随灌流速度的加快而提高，且流速过大可能会造成肠道黏膜壁的损伤，造成吸收速度与真实值相比有较大偏差。本实验采用0.2 mL·min-1进行灌流，该流速接近于空腹状态肠道的正常生理状态，所得实验结果与肠道真实吸收过程具有相关性。
3.4 分子量对药物吸收影响探讨小分子药物高分子化后，由于分子量的提高，其体内药代动力学数据会发生明显变化。本实验结果表明，随用于修饰5-ASA的mPEG分子量的变化，其肠道吸收呈明显降低趋势，表明用较高分子量PEG进行修饰能够有效抑制5-ASA的肠道吸收。因此将美沙拉嗪进行PEG化能够有效减少其小肠段吸收量，从而达到结肠靶向性的目的，并能避免或减少因美沙拉嗪小肠吸收而造成的相关毒副作用。
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